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微生物厌氧发酵生产维生素B12(ado-cobalamin,ado-cbI)同时会产生大量丙酸。传统发酵一般是进行细胞分离后提取胞内维生素B12而将含丙酸的发酵清液排放。本文针对传统发酵工业生产维生素B12存在的实际问题,开展了扩张床原位提取丙酸耦合维生素B12发酵的研究,建立起一种新型的以扩张床原位吸附为特征的生物反应过程,实现了丙酸/维生素B12的联合发酵。
对费氏丙酸杆菌维生素B12发酵过程的代谢进行了研究。通过带有二极管阵列检测器的HPLC和离子阱质谱的分析,发现了一种维生素B12关键中间产物,确定为腺苷钴啉醇酰胺(ado-cobinamide,ado-cbi)。Ado-cbi在5,6-二甲基苯并咪唑(DMB)的诱导下转化为维生素B12。建立了ado-cbi控制策略,指导发酵过程中DMB的添加,从而优化了厌氧生产维生素B12的发酵工艺。进行了100L放大实验,通过ado-cbi控制策略得到的ado-cbI预测值与测量值之间的偏差可以控制在1%以内。
采用离子交换吸附法分离发酵液中的丙酸。通过静态吸附实验,筛选出了一种弱碱性阴离了交换介质IPE-A,该介质在流化床中对发酵液中丙酸的吸附量达到51mg/g,并且选择性较好,在对发酵液吸附丙酸的过程中受发酵液环境影响较小。对该介质进行热力学初步研究表明,丙酸在IPE-A介质上的吸附遵循Langmuir吸附等温方程,拟合后线性系数达到0.998。
对丙酸抑制发酵的动力学进行了研究。考察了起始培养基中不同浓度丙酸对于细胞生长和丙酸合成的影响,确定了产物原位提取过程中分离单元的切入点为丙酸浓度10g/L。分批发酵试验对丙酸原位提取过程中设备模式进行了筛选,确定了外部-直接模式的产物原位提取设备,可以极大提高丙酸浓度、底物转化率以及底物消耗速率。
在确定了介质和设备模式的基础上,选用符合外部-直接模式的扩张床设备进行了从费氏丙酸杆菌发酵液中提取丙酸的吸附和解吸工艺研究,优化工艺参数为:发酵液pH5.0、上料流速为25mL/min、吸附时间20min,发酵液与介质体积比为10:1时介质动态吸附量为58mg/g;解吸剂NaOH3mol/L、流速1.32mL/min时解吸率达到93.2%。
进行了IPE-A介质的生物相容性实验。建立起了一种新型的以扩张床原位吸附为特征的生物反应过程,将该过程应用在丙酸/维生素B12联合发酵中,可以实现半连续方式将发酵液中的丙酸有效提取,从而消除了丙酸对发酵过程的抑制。通过160小时的补料分批发酵试验,获得了53g/L的丙酸和43mg/L的维生素B12,底物转化得率分别达到0.66g/g和0.54mg/g。