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小麦白粉病是由小麦白粉菌(Blumeria graminis f.sp tritici,Bgt)引起的世界性病害,近年来呈现出日趋严重的状况,目前已成为我国小麦优质高效生产的主要制约因素之一。鉴定小麦抗白粉病基因资源,对于小麦抗性遗传改良具有重要意义。簇毛麦(Haynaldia villosa)分布于地中海沿岸和近东的外高加索地区,为一年生二倍体异花授粉草本植物。它的突出特性是对白粉病免疫,另外,对叶锈病和秆锈病、全蚀病、眼斑病、小麦条斑病毒的传媒瘿螨、叶枯病和大麦黄矮病也具有较高抗性,是小麦品种改良的重要基因源。为鉴定克隆簇毛麦抗白粉病基因,研究其抗性的分子机制,本实验室前期利用大麦基因芯片杂交技术,克隆到了一个正向调控小麦抗白粉病过程的E3连接酶基因HvCMPG1(王慰,2010;费菲,2012),为了进一步阐明HvCMPG1的作用机制,李颖波(2014)构建了酵母双杂交文库,并在文库中筛选HvCMPG1的互作的cDNA克隆,其中一个克隆序列编码凝集素受体蛋白激酶基因。已有研究表明,LecRKs参与了植物的防卫反应。本研究在以上研究基础上,在簇毛麦中克隆LecRK-V基因全长,利用单细胞瞬间表达、病毒诱导的基因沉默和转基因互补试验研究LecRK-V基因在抗小麦白粉病过程中的功能,取得的主要研究进展如下:1.LecRK-V的克隆:以Hv CMPG1为诱饵筛选酵母双杂交文库,筛选到编码LecRK的cDNA克隆,测序并将该序列搜索现有基因组数据库,发现其与大麦AK367307.1序列同源,根据大麦序列设计引物,以簇毛麦叶片受白粉菌诱导24h后的cDNA为模板,克隆获得其ORF为1716bp的全长基因,该基因编码572个氨基酸,其编码蛋白包含胞外凝集素域、跨膜域和胞内激酶域,属于L-type凝集素受体蛋白激酶,将该基因定名为LecRK-V。2.LecRK的系统进化树构建:在已经测序的小麦及其近缘物种中,找出所有含有L-type凝集素受体激酶的序列,构建了 LecRK系统化树。根据其序列相似性,将麦类作物的LecRK分成8大类;利用MEME在线工具分别以凝集素域和激酶域作为query分析了其保守的基序。结果发现,第1类、第2类、第3类、第4类以及第5类LecRK中的凝集素结构域相对保守,而第6类第7类和第8类LecRK的激酶结构域相对保守。3.LecRK-V的亚细胞定位:利用TMHMM Servers v.2.0在线工具,对LecRK-V的氨基酸序列分析发现其190-212位氨基酸处存在一个跨膜信号。构建了LecRK-V表达载体pAN580-LecRK-V,利用小麦原生质体瞬时表达系统进行亚细胞定位,结果表明LecRK-V主要定位于细胞膜上,与之前的预测的结果相一致。4.LecRK-V的表达分析:利用qRT-PCR分析簇毛麦受白粉菌、几丁质、NaCl、PEG和4℃处理前后LecRK-V的表达谱。簇毛麦叶片受白粉菌混合小种诱导处理后45min时,LecRK-V基因快速上调表达4.25倍,在24h及以后表达量维持在3.15-4.33倍上调表达;簇毛麦叶片受几丁质处理后30min时,LecRK-V基因快速上调表达7.98倍;NaCl处理簇毛麦后,LecRK-V在1h时急剧上调表达至67.2倍,而后在3-6h恢复到初始水平;PEG处理簇毛麦后0-6h,LecRK-V的表达量没有显著变化,处理12h时有3.21倍的上调表达,24h-48h又下降至原来的表达水平;在受4℃低温处理后的0-12h,簇毛麦中LecRK-V的表达量没有明显变化,处理后24h开始上调表达,并在48h达到峰值,上调至9.75倍。表明,LecRK-V的表达受到白粉菌、几丁质和三种非生物逆境处理的调控,但表达模式存在差异。5.LecRK-V在抗白粉病中的功能分析:5.1单细胞瞬间表达分析:利用表皮细胞单细胞瞬间表达试验在中感白粉病的小麦品种扬麦158中瞬间表达LecRK-V基因,接种白粉菌混合小种,观察吸器指数的变化。结果发现,在单独转化GUS基因时,扬麦158叶片表皮细胞中白粉菌的吸器指数为60.68%;而当共转化GUS和LecRK-V基因时,吸器指数降为38.10%,表明瞬间表达LecRK-V显著提高了扬麦158对白粉病的吸器形成前的抗性。5.2 VIGS实验:利用大麦条花叶病毒诱导的基因沉默系统在二叶期的抗白粉病的硬粒小麦-簇毛麦中沉默LecRK-V基因,以接种γ空载和BSMV:PDS作为对照,qRT-PCR表明,与对照相比,接种BSMV:LecRK-V植株中,LecRK-V基因的表达量下降至0.26,说明BSMV:LecRK-V植株中的LecRK-V基因被有效沉默。在BSMV:PDS出现褪绿表型后分别离体接种白粉菌生理小种E26和E31,结果发现,对照与BSMV:LecRK-V植株叶片均未表现出明显的感白粉病表型,在显微镜下进一步观察白粉菌的发育情况,结果表明对照与BSMV:LecRK-V的植株上白粉菌均未能形成次级菌丝。推测由于在硬簇麦中因为还存在有其他抗白粉病基因,单独沉默LecRK-V不能导致其感病。5.3转基因试验:利用基因枪介导的遗传转化方法将融合了LecRK-V基因和CAMV35S启动子的载体pBI220-LecRK-V转化扬麦158幼胚愈伤组织,共获得280株再生植株;利用CAMV35S和LecRK-V基因设计组合引物进行PCR鉴定,结果发现其中9株为阳性转基因植株,转化效率为3.2%。qRT-PCR表明9株阳性植株的LecRK-V的表达量均高于扬麦158和阴性植株LecRK-V-T0-20-1。利用白粉菌混合小种对9株阳性植株进行苗期离体抗性鉴定,发现其均高抗混合白粉菌,表明LecRK-V基因过量表达可以提高小麦品种扬麦158的白粉病抗性。挑选LecRK-V上调表达量较高的两个转基因的植株(LecRK-V-T0-37-1和LecRK-V-T0-40-4),进一步研究其衍生后代中转基因的遗传及其功能。结果发现,二者分别衍生的T1代株系LecRK-V-T1-7和LecRK-V-T1-9中LecRK的表达量均高于扬麦158和转基因阴性株系,且所有植株对南京地区混合白粉菌表现出高抗,病级为0;T1代株系衍生的T2代株系LecRK-V-T2-7和LecRK-V-T2-9,经PCR鉴定LecRK-V-T2-7均为阳性株系,且LecRK-V的表达量均高于扬麦158和转基因阴性株系,表明转基因在后续代可以稳定遗传和表达;利用23个不同的白粉菌生理小种对LecRK-V-T2-7进行苗期活体抗性鉴定,发现其对18个生理小种表现高抗(病级0-1级),对其中22个生理小种表现出过敏反应;对LecRK-V-T2-7和LecRK-V-T2-9苗期叶片分别离体接种白粉菌生理小种E26和E31,二者均出现HR反应,接种E26后病级为0级,接种E31后病级为4级。6.ROS与LecRK-V介导的白粉病抗性的关系的初步分析:利用DAB染色法比较白粉菌单小种E26、E31接种后扬麦158、南农9918、LecRK-V-T2-7和转基因阴性株系LecRK-V-T2-1的H2O2的积累情况。结果发现,接种E26小种24h后,侵染点处出现活性氧爆发的比例分别为3.25%、20.27%、19.9%和3.07%,整个细胞都出现活性氧爆发的细胞为2.99%、14.26%、7.73%和2.92%;接种E31小种24h后,侵染点处出现活性氧爆发的比例分别为4.37%、12.21%、28.48%和6.47%,整个细胞都出现活性氧爆发的细胞为2.38%、22.52%、7.08%和3.79%。说明在接种白粉菌24h后,LecRK-V-T2-7的活性氧爆发高于扬麦158和转基因阴性对照。