论文部分内容阅读
耳聋是全球性的重大公共卫生问题。作为人口最多的国家,我国面临同样严峻的形势。2006年中国第二次残疾人抽样调查结果显示,我国听力言语障碍者2780万,占残疾人总数的33.5%。在听障者中,0～6岁儿童约有13.7万,每年新增先天性听力障碍患儿约3～4万;同时,我国每年新增药物性耳聋和迟发型耳聋儿童3万人左右。耳聋已严重影响我国人口素质。据统计,重度耳聋大约60%与遗传因素有关。根据是否合并其他系统疾病,可将耳聋分为非综合征型耳聋（nonsyndromic hearing loss,NSHL）和综合征型耳聋（syndromic hearing loss,SHL）,前者约占70%,后者占30%。遗传方式主要有四种:常染色体显性（15～20%）、常染色体隐性（80%）、性连锁（1%）和线粒体遗传（1%）。由于耳聋遗传的高度异质性,仍有大量耳聋患者的分子病因不明。近年来二代测序技术的发展,进一步完善了耳聋基因突变谱。在耳聋的防控上,明确分子病因是前提,产前诊断是重要手段。本研究鉴定了三种显性遗传性耳聋的分子病因,并在耳聋的无创产前检测方面进行了积极探索。第一部分 X-连锁显性非综合征型耳聋家系致病位点鉴定和表型差异分析本部分收集了一个X-连锁显性非综合征型耳聋家系（M60）,家系部分成员表现为迟发型进展性感音神经性聋,不伴其它表型。采用包括139个基因的panel行基因捕获和二代测序,鉴定该家系的耳聋分子病因为已知耳聋基因SMPX的新突变,SMPX c.29insA（p.NIOfs）。该家系成员中IV3、IV4均携带SMPX c.29insA,但IV3出现听力损失,IV4听力正常。在X连锁显性遗传性耳聋中,女性携带者表型差异原因未见详细报道,本课题组进一步研究表明该家系女性成员听力损失表型的差异与X染色体失活偏移密切相关。该结果可以更好地为家系成员提供遗传咨询和指导,并为X连锁显性耳聋的分析提供参考。第二部分常见综合征型耳聋致病位点鉴定综合征型耳聋患者由于同时伴有其他器官的异常,且表型变异大,遗传背景更复杂,临床上的治疗也更困难,因此早期诊断尤为重要。该部分对两种较常见的综合征型耳聋家系进行了表型特征分析,应用目标区域捕获测序和Sanger测序明确了分子病因。其中两个Van der Hoeve综合征家系的分子病因为COL1A1基因c.1342A>T（p.K448X）和c.124C>T（p.Q42X）,均未见报道;鳃-耳综合征家系的分子病因为EYA1基因 c.GTCC10751078GAT（p.G359fs,p.M365X）和EYA1 c.1319G>A（p.R440Q）,前者未见报道。上述两种综合征耳聋为常染色体显性遗传,家系患者将突变基因遗传给后代的风险为50%,生育风险高,建议行产前诊断。本研究明确了综合征型耳聋家系的分子病因,进一步确认了诊断,对患者其它系统疾病起到监测和预警作用,并且可以更好地为家系成员提供遗传咨询。第三部分耳聋无创产前检测研究遗传性耳聋分子诊断工作的不断成熟和完善是耳聋预防的基础,产前筛查和诊断是防控耳聋的重要手段。传统的产前诊断是通过侵入性方法获取胎儿组织用于遗传分析,对胎儿和孕妇有一定的风险。无创产前检测需要的胎儿遗传信息可以从孕妇外周血中游离DNA和胎儿细胞获得。该部分研究分别从两种不同胎儿遗传物质来源着手,针对常见耳聋基因的无创检测进行了探索。在游离DNA水平,我们采用了捕获试剂盒捕获富集游离DNA、二代测序,根据父母耳聋基因突变位点在血浆和白细胞中的突变频率差异,结合血浆中胎儿游离DNA浓度综合判断胎儿基因型。在30例耳聋基因产前诊断中,25例孕妇外周血游离DNA结果与羊水穿刺结果一致,5例胎儿无创产前筛查结果与羊水穿刺结果不符合（3例单杂合突变误诊为未见致病突变,1例复合杂合突变误诊为单杂合突变,1例单杂合突变误诊为纯和突变）,单基因病耳聋无创产前筛查诊断准确率为83.3%,灵敏度75%,特异度96.2%。在利用孕妇外周血中胎儿细胞进行无创产前检测方面本研究也进行了积极尝试,通过密度梯度离心、抗原抗体分选、单细胞显微操作等方法分离和富集的目标细胞,经MALBAC扩增后检测捕获细胞,结果稳定性、准确性有待提高。胎儿有核红细胞的捕获策略、单细胞全基因组扩增方法优化等核心环节将直接影响胎源细胞的纯度、得率和基因诊断结果的准确性,需要在下一步研究中实现技术突破。