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肽抗生素是一种具有巨大开发应用价值的生物活性物质,对耐药微生物、肿瘤等都具抑制、杀灭效用。放线菌是产抗生素的主要微生物,其中链霉菌产生的抗生素的种类最丰富。本实验针对肽抗生素的特性,设计筛选产肽抗生素链霉菌的实验方案,获得一株产肽抗生素的链霉菌,对其进行分类鉴定、发酵优化及产物提取研究。结果如下:
⑴筛选到一株链霉菌,命名为链霉菌caiF1(caiF1),其代谢产物具有排斥亚甲基兰、与Dragendorff试剂发生阳性反应、抑制、杀灭大肠杆菌等微生物的性质。活性代谢物被D152弱酸性阳离子交换树脂交换后,SDS-PAGE聚丙烯凝胶电泳可被检测到2条带纹,其中一条带纹的分子量约为14 kD,无生物抑菌活性;另一带纹的分子量约为4.2 kD,有生物抑菌活性。
⑵链霉菌caiF1在高氏一号合成琼脂培养基上,气丝白色,丰富,分支生长,呈线形,无分隔;孢子丝波曲、成钩或长柄螺旋,顶端形成1—3个不等的螺旋,圆柱状,孢子椭圆形;基丝微黄色,生长良好,无分支,无横隔。在高氏一号等7种培养特性培养基上,气丝白色,基丝无色至灰,褐色不等,可溶性色素灰黑色。明胶液化,产褐色色素;无牛奶固化;牛奶胨化,使牛奶变成黄褐色的清澈液体;无淀粉水解酶活性;无纤维素酶活性;产硫化氢;有硝酸盐还原活性;利用葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露醇、甘油、肌醇。链霉菌caiF116S rDNA序列测序分析,获得1063 bp碱基片段,Genebank比对显示其与枝链霉菌的相似度达到99%。根据《链霉菌鉴定手册》及16S rDNA序列分析比对结果,链霉菌caiF1属于链霉菌属,白孢链霉菌类群,白孢亚群,枝链霉菌的一个变种。
⑶链霉菌caiF1的生长周期为108 h,孢子接种24 h后进入对数生长期,84 h后进入稳定期。发酵优化后,链霉菌在发酵培养基:20 g·L-1甘油,9 g·L-1大豆蛋白胨,0.8 g·L-1(NH4)2SO4,1 g·L-1Na2HPO4,0.8 g·L-1KH2PO4,0.001 g·L-1FeSO4,0.25 g·L-1MgSO4,0.005 g·L-1 ZnSO4;种子液培养60 h,8%接种量,20%装液量,初始pH6.8,28℃,220 rpm,摇床发酵96 h,20μL发酵液的抑菌圈直径为2.53 cm,生物抑菌活性达到最高。
⑷链霉菌caiF1产生肽抗生素的热稳定性好,酸稳定性好,抗菌谱广,碱稳定性差,紫外270 nm弱吸收、208 nm强吸收。D152弱酸性阳离子交换树脂离子交换介质及聚丙烯葡聚糖凝胶Sephacryl S—100过滤介质能较好分离纯化链霉菌caiF发酵液中的肽抗生素;纯化物在L—6高效液相色谱仪检测显示有效成分含量为90.874%,SDS-PAGE检测为4.2 kD的单一条带。