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目的miRNA (micro ribonucleic acid,微小核糖核酸)是一种单链非编码小分子RNA(ribonucleic acid,核糖核酸),在基因表达调控方面具有广泛和普遍的作用,但目前对其在骨折愈合与不愈合中的调控作用尚知之甚少。本研究拟首先筛选萎缩性骨不连修复组织中异常表达的miRNA种类,并通过生物信息学方法预测表达上调miRNA的成骨功能相关靶基因,再从细胞水平验证萎缩性骨不连组织中表达上调miRNA对预测靶基因的调控作用,从而阐明miRNA在萎缩性骨不连发病过程中的调控作用及其分子生物学机制,为骨不连的基础和临床研究提供理论和实践依据。方法(1)以临床患者萎缩性骨不连修复组织(A组,3例)与正常骨折愈合后内固定钢板取出时钢板周围骨痂组织(B组,3例)为研究对象,采用Exiqon miRCURYTM LNA microRNA芯片(11.0版)对各组织中提取的RNA进行miRNA筛选分析。在筛选出萎缩性骨不连组织中异常表达的miRNA后,采用荧光qRT-PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,实时定量聚合酶链反应)对芯片结果中A组表达上调的miRNA在两种组织的表达水平进行验证,并采用浏览计算机预测数据库的生物信息学方法预测其可能的靶基因,探寻miRNA可能参与的骨折愈合和萎缩性骨不连相关病理生理过程。(2)上调miRNA与预测靶基因关系的验证：取人骨髓全血,离心分离hBMSCs (human bone mesenchymal stem cells,人骨髓基质干细胞),传代培养。将人工合成的四种表达上调miRNA的双链小RNA转染入第四代hBMSCs,48小时后提取细胞总RNA,采用qRT-PCR、WB (Western Blotting,蛋白印迹)、双荧光素酶报告基因检测等多种方法,验证miRNA对预测靶基因的作用,确认miRNA在萎缩性骨不连中的具体调控作用和分子生物学机制。(3) miRNA和相应靶基因在诱导hBMSCs成骨分化过程中表达水平及功能的相关研究：采用成骨诱导培养液诱导hBMSCs成骨分化的方法,观察在诱导hBMSCs成骨分化过程中不同时间点(0,12h,1d,2d,4d,7d,14d)相应miRNA、靶基因mRNA(messenger ribonucleic acid,信使核糖核酸)与蛋白表达水平的变化趋势,进一步验证这些上调miRNA在诱导成骨分化中的调控作用,并探讨成骨诱导培养液的诱导成分在此过程中促进成骨分化的作用。结果(1)萎缩性骨不连修复组织相对钢板周围骨痂组织有9种miRNA发生1.5倍以上表达上调(hsa-miR-149*, hsa-miR-221, hsa-miR-628-3p, hsa-miR-654-5p,以及5种hsa-miRPlus),9种miRNA发生1.5倍以上表达下调(hsa-let-7b*, hsa-miR-220b, hsa-miR-513a-3p, hsa-miR-551a,hsa-miR-576-5p,hsa-miR-1236,kshv-miR-K12-6-5p,以及2种hsa-miRPlus).qRT-PCR结果提示,数据库中收录并在A组表达上调的四种miRNA在组织水平的表达变化趋势与芯片结果一致。生物信息学分析发现,四种表达上调miRNA的预测靶基因包括多种成骨功能相关基因。(2)分离培养的hBMSCs具有典型的干细胞形态特征,贴壁时间短,细胞融合快,体外扩增容易,可以向成骨细胞诱导,适合作为种子细胞用于后续的实验研究。在成功将上调miRNA的合成双链小RNA转染进第四代hBMSCs48h后,提取细胞总RNA,qRT-PCR检测表明,三种预测靶基因(hsa-miR-149*的预测靶基因ALPL、 hsa-miR-221的预测靶基因PDGFA和hsa-miR-654-5p的预测靶基因BMP2)的mRNA表达量受到明显抑制,其余预测靶基因的mRNA无明显下降；WB则表明上述三种预测靶基因的蛋白表达量均受到明显抑制。双荧光素酶报告基因检测则证明三种预测靶基因的预测靶位点分别直接受到hsa-miR-149*、hsa-miR-221和hsa-miR-654-5p的靶向调控,其中ALPL的两个预测靶位点只有第二个受到hsa-miR-149*的直接调控。(3)诱导hBMSCs成骨分化过程中,得到确认的成骨性靶基因ALPL.PDGFA和BMP2的mRNA和蛋白表达量在多数时间点有明显增加,尤其以诱导分化后2～7天变化最为显著(ALPL蛋白为1～7天),第14天时又有所下降。不同时间点的miRNA.靶基因mRNA和蛋白水平存在表达差异,其中hsa-miR-149*和hsa-miR-654-5p的变化趋势与各自靶基因ALPL和BMP2的mRNA及蛋白表达水平总体上呈负相关,而hsa-miR-221与PDGFA的变化趋势无明显负相关关系,两者的关系有待进一步研究。结论(1)萎缩性骨不连修复组织中存在miRNA的异常表达；四种在该组织中上调的miRNA(hsa-miR-149*、hsa-miR-221、hsa-miR-628-3p和hsa-miR-654-5p)有可能通过抑制多种成骨功能相关靶基因的表达,在调控骨折向萎缩性骨不连发生发展中发挥重要作用。(2)细胞水平验证表明：四种在组织水平上调的miRNA中,hsa-miR-149*与其预测的靶基因ALPL、hsa-miR-221与其预测的靶基因PDGFA、hsa-miR-654-5p与其预测的靶基因BMP2之间存在直接调控作用,异常上调的miRNA通过抑制成骨功能相关靶基因ALPL、PDGFA和BMP2的表达而限制其生物学功能,引起了萎缩性骨不连的发生发展。(3)多种成骨功能相关靶基因的mRNA和蛋白表达水平在诱导hBMSCs成骨分化过程中大多数时间点发生了表达上调,hsa-miR-149*和hsa-miR-654-5p与其相应靶基因ALPL和BMP2的mRNA及蛋白表达变化趋势呈负相关,说明这两种miRNA在诱导成骨分化过程中与其靶基因mRNA和蛋白表达水平的调控密切相关。简述之,本研究从萎缩性骨不连修复组织中找到具有关键调控作用的miRNA,发现有三种表达异常上调的miRNA通过抑制成骨功能相关靶基因引起了萎缩性骨不连的发生发展,其中两种miRNA的表达水平与成骨功能相关靶基因的mRNA和蛋白表达水平密切相关。本研究可能将为萎缩性骨不连的诊断和治疗提供新的理念。