近年来,随着人们的生活水平不断提高,心脑血管疾病的患病率不断增加。据悉,全球每年有1200万人死于心脑血管疾病,受其影响而生活不便的人们更是不计其数。心脑血管疾病最大的病因在于血管栓塞,治疗的关键在于疏通血管保持血液流动畅通,目前临床上的治疗药物主要是急救药,存在药效短、有出血副作用等缺点,新型溶栓药物的研发已是大势所趋。本课题研究的是一种极具潜力的新型溶栓药物——枯草杆菌纤溶酶QK。它是一种与纳豆激酶高度同源的丝氨酸蛋白酶,能靶向降解血栓骨架——交联纤维蛋白,具有较高的溶栓活性和较长的药物半衰期,作为治疗心脑血管疾病的新型溶解血栓药物,具有良好的应用前景。在王业富教授课题组前期的研究中,通过挑选野生型菌株、优化发酵条件等方式,得到了提高QK纤溶活性的方法,并通过凝胶过滤层析等方式进行纯化,得到了纯度高于95%的纤溶酶QK。纤溶酶QK在生产工艺上已较为成熟,但是我们对于其溶解血栓的分子机制尚不清楚。在此背景下,该课题探索了QK的氨基酸位点与酶活之间的相关性,并初步解析了纤溶酶QK的蛋白晶体结构,探索了蛋白结构与溶栓功能之间的关系,为纤溶酶QK的药物开发提供理论基础,为心脑血管疾病的防治提供新的用药选择。研究内容归纳为以下四个方面:（1）从不同来源的枯草杆菌纤溶酶粉中筛选到15株枯草芽孢杆菌菌株,以这15株菌株的总DNA为模板,扩增它们的QK基因,测序后与Gen Bank上已提交的QK基因所对应的蛋白序列（Gene Bank编号:CAE18180.2）进行比对,找出氨基酸差异位点。根据突变位点的不同把15株菌株分为A、B、C、D四组,其中,A组的突变位点为S184T;B组的突变位点为Q90K,N193S,S236T,N365S,C组的突变位点为N193S,S236T,A289V;D组的突变位点为Q90K,N193S,S236T,A289V。（2）使用纤维蛋白平板法测定菌株所产纤溶酶的活性,用BCA蛋白测定试剂盒测定发酵液的总蛋白含量,前者与后者的比值计算得到单位酶活。A组的单位酶活显著最高（p<0.05）,平均为9.9IU/mg;B、C两组之间单位酶活平均值分别为3.39IU/mg和2.69IU/mg,两组之间无显著性差异（p>0.05）,但B、C两组单位酶活显著小于A组（p<0.05）;D组单位酶活平均值为0.19IU/mg,显著低于其他三组（p<0.05）。（3）选择单位酶活性最高的菌株,对其产生的纤溶酶QK进行纯化,得到可以用于晶体培养的高纯度纤溶酶QK。使用晶体筛选试剂盒,采用悬滴法进行晶体培养条件的筛选与优化,成功得到了高质量的片状蛋白晶体。晶体培养温度为16℃,蛋白浓度为15mg/m L,池液条件0.1M Bicine p H9.0,2%1,4-二氧六环,10%w/v聚乙二醇（PEG）20,000和0.2 M氟化钠（Na F）,p H7.3,20%w/v PEG3,350。（4）将获得的晶体进行X射线衍射,得到分辨率为1.9?的衍射数据,使用HKL2000、CCP4、COOT、Phenix等软件进行数据处理和解析,得到了纤溶酶QK的晶体结构。晶体属于P1 2₁1空间群,晶胞属于单斜晶系,晶胞参数键长a=74.1?,b=79.4?,c=87.4?,键角?=90.0°,?=111.5°,?=90.0°,完整性达到了99.6%。本研究探索了枯草杆菌纤溶酶QK的溶栓活性与氨基酸位点的相关性,找出了可能对单位酶活有影响的氨基酸位点。对最高单位酶活的枯草芽孢杆菌产生的纤溶酶进行纯化结晶,得到了高质量蛋白晶体并成功解析了晶体结构,这对研究纤溶酶QK的溶栓活性机制提供了理论基础。