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烟草蚀斑病毒中编码的蛋白酶TEV(Tobacco etch virus protease,TEV)是在生物学中具有特殊作用的催化酶。其蛋白分子量大小为27 kDa,具备高度特异性。由于其高度特异性和高活性,且在不同的反应缓冲液中都能保持较高的酶切效率。所以在重组蛋白质的表达、纯化中被广泛用于切除融合标签。也得到科研学者高度认可和广泛应用。实验设计目的是通过基本的构建载体,蓝白斑筛选实验等。得到一种能被TEV特异性切割的TEV酶识别底物。传统的TEV酶活分析依赖SDS-PAGE电泳、酶切产物的灰度分析,操作繁琐,且难以精确定量。本研究通过构建一系列融合蛋白,对TEV酶的底物进行筛选,利用α肽与LacZ互补建立一种TEV酶活性分析的灵敏方法。本实验构建了一系列载体pQE2-MBP-α、pQE2-MBP-α-ACP、pQE2-DsbA-α-ACP、pBAD24M-DsbA-α-ACP、pBAD24M-DsbA-α,通过蛋白高效表达以及体外TEV酶切分析,对构建的融合蛋白(TEV酶底物)进行了初步筛选,同时在菌株DH5α、JM109中将构建的融合蛋白与TEV酶共表达,利用TEV酶切产物α肽与β-半乳糖苷酶(LacZ)缺陷型菌株(DH5α、JM109)体内大片段LacZΔM15互补,细菌体内产生具有催化活性的β-半乳糖苷酶,β-半乳糖苷酶水解底物5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside(X-gal)显色,最终能筛选得到一种用于TEV活性分析的适宜底物。通过一系列蓝白斑实验验证,成功筛选得到了融合蛋白DsbA-α,其在大肠杆菌体内能稳定积累,单独表达时蓝白斑筛选呈白色,与TEV酶共表达时,蓝白斑筛选时呈蓝色;当与不同活性的TEV(MBP-TEV、MBP-Ybbr-TEV、MBP-ACP-TEV)共表达时,蓝色菌落出现的时间存在差异,活性越高,蓝斑出现的时间越短,结果表明,本论文建立了一种TEV酶活性分析的灵敏方法。