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口蹄疫(Foot and Mouth Disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus,FMDV)所引起的偶蹄动物的一种急性系统性水泡病。FMDV为RNA病毒,分7个血清型,即A、O、C、Asial(统称为亚欧型)和南非型(Southern African Territories,SAT)1、2、3(统称为南非型)。FMDV SAT具有特别明显的地域性,主要局限于非洲地区。但据近几年报道,SAT FMDV在中东地区出现,对我国养殖业构成了潜在的威胁。因此有必要建立简单、快速、特异、灵敏的SAT FMDV的诊断方法,以作为一种战略储备技术。本研究旨在建立起一种SAT FMDV常规RT-PCR诊断方法,而VP1编码区基因1D是进行FMDV分型的依据,具有血清型的特异性,而非结构蛋白编码区2B保守性较好,所以本试验通过分析比较最终把SAT FMDV诊断靶区域定位于FMDV的1D2A2B区域。由于我国历史上没有SAT FMD,为了保障生物安全性并满足实验需要,在比较分析SAT FMDV核酸序列同源性基础上,挑选出8个SAT1型、10个SAT2型和3个SAT3型的代表毒株,合成该些毒株的1D2A2B基因,并构建出相应的重组质粒,经鉴定分析正确后用于后续试验。引物设计为建立RT-PCR方法的关键,而SAT FMDV的1D基因变异度大(70%-85%),所以,复合引物为本试验的最优选择。通过3个SAT型代表毒株1D2A2B序列的分析与比较,选取了1D基因3’端作为上游引物设计的靶区域,下游引物在保守性较好的2B区。通过试验检测,最终筛选出一套由7条上游引物和1条下游引物组成的复合引物,命名为SAT-D 8。以上述重组阳性质粒为模板,SAT-D8为引物对,首先在DNA水平上建立了FMDV SAT-D8RT-PCR检测方法。以上述21个质粒为模板,都能特异性地扩增出257bp的目的条带。进一步通过体外转录法制备出21个毒株1D2A2B基因的RNA转录本,以此为模板,也都能够扩增出特异的目的条带。该方法不与A、O、C和AsiaI型FMDV以及BVDV、ORFV、SPPV/GTPV、SVDV、BTV、PRRSV、CSFV、PRV、PPV、PCV等病毒发生交叉反应。以质粒为模板,该方法的灵敏度可达到102拷贝数/微升,以RNA转录本为模板,灵敏度为103-104拷贝数/微升,比DNA水平上的灵敏度低10-100个拷贝数/毫升。以3份源自英国Pirbright实验室的阳性灭活抗原SAT1/2/3和125份源自我国牛猪羊的心、肝、脾、肺、肾、舌面组织及血清作为待检样品,提取其RNA后,进行SAT-D8 RT-PCR实验。结果表明,以SAT1/2/3灭活抗原RNA为模板,扩增出预计的SAT FMDV阳性条带。阳性条带的进一步序列分析表明为SAT型。其它125份田间样品检测结果全为SAT阴性。在建立了FMDV SAT-D8常规RT-PCR检测方法基础上,组装了相应的试剂盒,-20℃保存,定期取出检测。在保存至第6个月时试剂盒稳定性良好。本实验还需要大量的田间样品,尤其是SAT阳性样品的验证,以及在更长保质期条件下的试剂盒稳定性检测。通过上述试验,本研究成功地建立了FMDV SAT-D8常规RT-PCR检测方法,具有特异性强和灵敏度高的优势。组装的试剂盒在-20℃保存6个月后稳定性良好,这为研发南非型FMDV检测试剂盒奠定了基础。