背景PD-1阻断疗法治疗黑色素瘤已经应用于临床,但依然有部分病人没有明显疗效。研究指出,PD-1阻断激活T细胞还需依赖CD28,然而在很多患者T细胞表面该分子丢失了,这是造成PD-1治疗耐受的重要原因。我们前期研究发现,减毒沙门菌运载siRNA-PD-1能够有效抑制黑色素瘤生长,然而荷瘤小鼠对该疗法的反应也不一致。与治疗有效小鼠相比,治疗无效小鼠细胞表面CD28的表达明显降低。因此,我们构建了一个pCD28-siRNA-PD-1共表达质粒,研究了其对于黑色素瘤荷瘤小鼠的治疗作用,期望通过提高CD28的表达来提高siRNA-PD-1的疗效。本课题将为临床上CD28低表达的黑色素瘤患者应用PD-1干预治疗提供一定的理论及实验依据。目的研究探讨运载pCD28-siRNA-PD-1共表达质粒的减毒沙门氏菌抗黑色素瘤的作用及机制。方法1.细胞实验将状态良好的EL4细胞铺在六孔板中(3×10~5/孔),孵育18h。取不同克隆的pCD28-siRNA-PD-1质粒转染至EL4细胞中,设对照组,继续培养24h;通过Western blot检测转染后细胞裂解物中PD-1与CD28的表达。2.动物实验黑色素瘤荷瘤小鼠模型建立后第7天,将接种成功小鼠随机分为五组,分别为PBS组、Scramble组、CD28组、siRNA-PD-1组和pCD28-siRNA-PD-1组,在第7和14天分别给予PBS、Scramble、pcDNA3.1-CD28、siRNA-PD-1、pCD28-siRNA-PD-1菌液进行给药治疗,共治疗两次。观察荷瘤小鼠的出瘤情况并监测肿瘤体积的变化;通过Western blot的方法检测肿瘤组织中CD28,PD-1,CD4,CD8等相关蛋白的表达变化;通过免疫荧光的方法检测肿瘤组织中CD4~+和CD8~+T细胞的浸润情况以及TUNEL实验检测细胞凋亡的发生情况;通过FACS方法检测脾脏中CD4~+和CD8~+T细胞,CD4~+CD25~+Foxp3~+调节T细胞以及NK细胞的比例,此外同时检测小鼠外周血中相关免疫细胞的比例;通过体外分离培养脾脏淋巴细胞进行CTL体外杀伤实验检测不同治疗组肿瘤特异性细胞毒性T细胞比例。结果1.siRNA-PD-1与CD28共表达质粒体外显著抑制了EL4细胞中PD-1的表达,增加了的CD28表达;2.在黑色素瘤荷瘤小鼠实验中,运载siRNA-PD-1与CD28共表达质粒的减毒沙门氏菌更加显著的抑制了小鼠肿瘤的生长,提高了荷瘤小鼠的生存率;3.运载siRNA-PD-1与CD28共表达质粒的减毒沙门氏菌增加了肿瘤组织中细胞的凋亡情况;4.运载siRNA-PD-1与CD28共表达质粒的减毒沙门氏菌增加了肿瘤组织中CD4~+及CD8~+T细胞的浸润;5.运载siRNA-PD-1与CD28共表达质粒的减毒沙门氏菌抑制了肿瘤组织中细胞表面分子PD-1的表达,增强了CD28分子的表达;6.运载siRNA-PD-1与CD28共表达质粒的减毒沙门氏菌增强了肿瘤组织细胞中相关蛋白CD4、CD8及CD28的表达,抑制了PD-1的表达;7.运载siRNA-PD-1与CD28共表达质粒的减毒沙门氏菌增加了荷瘤小鼠脾脏中CD4~+、CD8~+T及NK细胞淋巴细胞的比率,降低了Treg细胞的比率;8.运载siRNA-PD-1与CD28共表达质粒的减毒沙门氏菌抑制了荷瘤小鼠血液中PBMC表面PD-1的表达,增强了细胞表面CD28的表达;9.运载siRNA-PD-1与CD28共表达质粒的减毒沙门氏菌增强了脾脏中淋巴细胞中CTL的杀伤功能。结论减毒沙门菌运载pCD28-siRNA-PD-1显著抑制了黑色素瘤荷瘤小鼠的肿瘤生长,一定程度上解决了PD1阻断疗法治疗无效的问题,提高了生存率,增强小鼠的抗肿瘤免疫反应。该课题为临床上PD-1阻断疗法单一治疗肿瘤无效提供了一种新的潜在的治疗策略。