机体生命活动的维持依赖于稳定的睡眠/觉醒状态。生理状态下,经体内外多种因素的调节,睡眠和觉醒状态进行着有条不紊的转换,从而保证机体多种生理功能协调有序的执行。在睡眠/觉醒周期的不同状态中,快速眼动睡眠(rapid eye movement sleep,REM sleep)由于其独特的脑肌电状态和与睡梦的客观联系受到了广泛的关注。系列研究表明,位于脑干的蓝斑底核(sublaterodorsal tegmental nucleus,SLD)是REM睡眠产生和维持的关键核团。SLD神经元在REM睡眠启动之前开始放电,且其放电活动持续至整个REM睡眠结束,这一过程被认为是REM睡眠起始和维持的核心。进一步研究表明,SLD中谷氨酸能神经元通过上行投射参与REM睡眠期间皮层海马脑电的激活,通过下行至巨细胞网状核/脊髓的投射参与REM睡眠期间肌张力缺失的维持。有意思的是,多种REM睡眠相关信息,如乙酰胆碱、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)、去甲肾上腺素和谷氨酸等,均可以通过直接调控SLD神经元的活动,进而参与REM睡眠的调节。值得注意的是,下丘脑orexin系统在睡眠/觉醒状态的调控中发挥了核心作用,其缺失会导致嗜睡-猝倒症(narcolepsy-cataplexy)的发作。在临床上,这类病人除了表现为不能维持稳定的觉醒状态之外,还表现为严重的REM睡眠异常,包括REM睡眠行为障碍(rapid eye movement sleep behavior disorder,RBD)、睡眠麻痹(sleep paralysis)等。与之一致的是,orexin神经元仅仅在进入非快速眼动睡眠(non-rapid eye movement sleep,NREM sleep)的时候停止放电,但是在REM睡眠期间,orexin神经元的活动又表现为增强,而且,微透析实验表明在REM睡眠期间,orexin神经肽的释放水平也出现升高。最新研究报道,orexin纤维可以直接投射到SLD脑区,但是SLD脑区的orexin信号通路基础、orexin对SLD神经元及神经网络的影响这些问题都亟待研究。因此,本文首先采用形态学结合电生理技术来研究orexin对SLD神经元的调控作用。发现在我们关注的SLD区域,orexin能纤维和受体均有表达。有意思的是,电生理结果显示orexin不仅仅在SLD神经元上引起了一个广泛的兴奋效应,而且还增强了SLD神经网络中电突触的活动。因此,我们进一步采用膜片钳技术结合神经药理学手段来研究这两种调控作用相关的电生理机制。现将主要结果详细阐述如下:1.Orexin对SLD神经元活动的调控作用(1)下丘脑orexin能系统主要作用于SLD谷氨酸能神经元本文首先观察了SLD脑区(前囟:-9.2～-9.8 mm)orexin能纤维的投射情况以及orexin受体的表达模式。通过免疫荧光染色,我们发现在该区域,orexin能纤维呈曲张体样表达于orexin受体阳性细胞周围;进一步的免疫荧光双标实验表明,在这一SLD区域主要分布有谷氨酸能神经元(97%),而且orexin受体表达于SLD的谷氨酸能神经元上,GABA能阳性染色信号主要呈纤维末梢样地表达于orexin受体阳性细胞周围。这些结果表明orexin信号途径主要作用于SLD的谷氨酸能神经元。(2)Orexin直接去极化SLD神经元并提高了存在电突触活动的SLD神经元比例我们采用全细胞膜片钳技术,将SLD神经元的膜电位逐渐钳制到-60 mV左右,观察到有21例(21/32,65.6%)神经元都存在阈下“spikelet”膜电位波动,该阈下“spikelet”膜电位波动可被电突触的非选择性阻断剂CBX(carbenoxolone,100μM)完全阻断,而且进一步的免疫荧光实验证明SLD区域确实有电突触的表达。应用100 n M的orexin-A在所有记录的32个SLD神经元上引起了7.9±0.8 mV(n=32,P<0.01)的去极化反应,除此之外,100 nM的orexin-A还使得存在阈下“spikelet”膜电位波动的SLD神经元比例从65.6%上升到84.4%。以上结果表明orexin除了直接影响单个SLD神经元的兴奋性外,还能增强将SLD神经元耦联成网络的电突触的活动。(3)Orexin在SLD神经元上引起伴随着增强的规律性噪声样波动的内向电流进一步的电压钳观察表明,30-300 n M的orexin-A呈剂量依赖地在全部测试的8个SLD神经元上引起稳定的内向电流。30、100、300 n M的orexin-A所诱发的内向电流的反应幅度分别为-12.1±3.0,-22.7±3.6和-37.0±8.7 p A(n=8)。另外,由orexin引起的这个内向电流,还同时伴随着电突触活动增强的信号——增强的规律性噪声样电流波动,30、100、300 n M的orexin-A增强的内向电流噪声水平分别为17.0±8.2%,64.1±18.6%和91.8±20.7%(n=8)。2.Orexin调控SLD神经元活动的机制(1)Orexin在SLD神经元上引起的伴随着增强的规律性噪声样波动的内向电流依赖于突触后orexin-1型和orexin-2型受体的激活Orexin引起的膜电流变化(n=7,P=0.528)和内向电流噪声水平的增强(n=7,P=0.854)均不受化学突触阻断剂的影响。应用orexin-2型受体阻断剂TCS OX2 29(1μM),部分阻断了orexin-A在SLD神经元上引起的内向电流反应(n=6,P<0.05)和基线噪声水平的增强(n=6,P<0.05)。进一步加入orexin-1型受体阻断剂SB 334867(1μM),则几乎完全阻断了orexin引起的内向电流反应(n=6,P<0.01)和基线噪声水平的增强(n=6,P<0.05)。根据以上结果我们可以得出结论,orexin在SLD神经元上引起的伴随着增强的规律性噪声样波动的内向电流是由突触后orexin-1型和orexin-2型受体共同介导的。(2)Orexin直接兴奋2/3 orexin受体阳性SLD神经元并将兴奋效应通过电突触扩布到整个SLD神经元网络电压钳模式下,100μM的CBX几乎完全阻断了orexin在SLD神经元上引起的增强的规律性噪声样电流波动(n=15,P<0.05),但orexin-A引发的内向电流也被部分减弱(n=15,P<0.01),且其中的4个(4/15,26.7%)SLD神经元上内向电流几乎被完全阻断。我们进一步应用特异性更高的CX-36(connexin-36)的选择性阻断剂,MEF(mefloquine,10μM),结合biocytin标记的膜片钳记录及免疫组化检测,我们发现MEF也减弱了orexin-A引起的内向电流(n=25,P<0.05),同样的,在所有记录的22个SLD神经元中,有6个(24%)神经元对100 n M的orexin-A没有产生反应。有意思的是,后染色结果显示,对orexin-A没有产生反应的6例神经元均不表达orexin受体,而其他神经元则均表达orexin受体。基于以上结果,我们进一步对orexin-1/2型受体和NeuN进行免疫荧光双标。结果显示,在统计区域,33.1%(45/136)的SLD神经元不表达orexin受体,这个比例与电生理实验的结果相近。综上所述,我们认为仅有约2/3的SLD神经元表达orexin受体,orexin在SLD神经元上引起的兴奋效应可以通过神经元之间的电突触联系扩散到整个SLD神经元网络。此外,orexin-A引起内向电流的幅度并不受TTX(tetrodotoxin,1μM)的影响(n=8,P=0.059),但增强的规律性噪声样波动(n=8,P<0.05)却被TTX完全阻断。这提示我们,是orexin在orexin受体阳性的SLD神经元上引起的去极化通过电突触扩散到整个SLD神经元网络,从而引起SLD神经元的广泛兴奋效应。(3)Orexin在2/3 orexin受体阳性SLD神经元上引起的直接兴奋效应是由非选择性阳离子通道的开放介导的为了明确orexin引起orexin受体阳性SLD神经元直接兴奋效应下游的离子机制,我们开展了以下一系列实验。通过绘制orexin-A在SLD神经元引起净电流的I-V曲线,发现orexin引起的净电流的翻转电位在-26.5±2.5 m V(n=8)且斜率为正值,接近于文献报道的非选择性阳离子通道(non-selective cationic conductance,NSCCs)的平衡电位。我们接下来减少了脑脊液中Na~+的浓度(从152.25 mM减少到70 mM),发现改变胞外Na~+浓度降低了orexin-A引起内向电流的幅度(n=8,P<0.01)。而且,orexin-A引起的净电流的翻转电位往更负的方向移动到-42.3±3.2 mV,但Na~+/K~+渗透比没有发生明显改变(n=8,P=0.338)。此外,应用NSCCs的阻断剂,Flu(flufenamic acid,100μM),orexin-A在SLD神经元引起的内向电流几乎被完全阻断(n=6,P<0.05)。通过以上实验,我们阐明了orexin在SLD神经元引起的直接兴奋效应是由NSCCs的开放所介导的。(4)Orexin增加了SLD神经元网络中的电突触电导我们结合药理学手段开展了double-patch的膜片钳实验来研究orexin对电突触的直接调控作用。首先,我们计算了每一对电突触耦联的SLD神经元之间的连接效率,发现100 nM的orexin-A同时增强了cell1到cell2(n=7,P<0.05)和cell2到cell1(n=7,P<0.05)的连接效率。此外,我们还计算了加入orexin-A前后每一对电突触耦联SLD神经元的电突触电导,发现orexin-A同时增加了cell1到cell2(n=7,P<0.05)和cell2到cell1的电导值(n=7,P<0.05),但是并没有影响cell1(n=7,P=0.676)和cell2(n=7,P=0.057)的输入阻抗。上述结果表明,orexin通过增加电突触电导来增强SLD神经元网络的电突触连接效率。综上所述,本文揭示了orexin信号途径一方面可以通过直接的突触后效应兴奋orexin受体阳性SLD神经元,另一方面通过增加电导增强SLD神经元之间的电突触联系。这两种调控作用导致的结果是,orexin在orexin受体阳性神经元上引起的兴奋效应可以通过SLD神经元之间增强的电突触联系传递到整个SLD神经元网络。因此,orexin能够整合性地影响整个SLD神经元网络的活动,使其整体更广泛、高效地兴奋,并可增强其同步化活动的程度。本文为研究REM睡眠调控提供了新的神经网络机制,并为理解orexin缺陷导致的REM睡眠相关疾病的发病机制提供了新的研究方向。