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在肿瘤的形成和发展过程中,常常伴随着营养物质和氧气的供给不足[1]。特别是在实体瘤的迅速增长过程中,由于相对血供不足,常导致瘤体内的许多区域缺乏氧气和葡萄糖等营养物质[2]。在这种情况下,肿瘤细胞必须通过代谢模式的改变以适应恶劣的微环境。肿瘤细胞代谢重编程最为熟知的当属Warburg效应,其典型特征是主要通过增强产能效率低下的糖酵解途径来生产ATP并伴随大量乳酸的形成[3]。除此之外,肿瘤细胞也常常发生谷氨酰胺代谢和脂代谢的重编程[4],例如在缺乏葡萄糖等应激情况下,肿瘤细胞通过增强脂肪酸氧化分解来提供能量和营养物质,维持细胞存活[5,6]。由于这种对代谢应激的适应能力,在临床抗血管生成药物治疗后,复发的肿瘤细胞甚至表现出更强的增殖和转移能力[7]。因此,研究肿瘤代谢重编程的分子机制具有重要的理论意义,也能为肿瘤的分子靶向治疗提供新策略。NDRG2是我们课题组首先报道的抑癌基因,在人体多种肿瘤组织中低表达,过表达NDRG2后可以抑制多种肿瘤细胞系的增殖、迁移和侵袭[8]。另外,NDRG2还参与细胞的多种应激反应[9]。更为重要的是,越来越多的研究证实NDRG2与肿瘤细胞代谢有密切关系。我们前期的研究发现,NDRG2能够抑制乳腺癌细胞的葡萄糖摄取和结肠癌细胞的糖酵解和谷氨酰胺代谢[10,11]。然而NDRG2是否参与肿瘤细胞脂代谢还未见报道。基于此,本课题拟以过表达NDRG2的肝癌细胞为研究模型,探讨实体瘤因微环境异质性和基质脱落等代谢应激条件下NDRG2在肝癌细胞中的作用。目的:1.明确代谢应激时NDRG2对肝癌细胞存亡的影响2.研究缺糖应激时NDRG2对肝癌细胞能量及氧化还原状态的影响3.探究NDRG2在肝癌细胞缺糖应激中所起作用的分子机制方法:1.利用慢病毒感染构建过表达NDRG2的肝癌细胞系Huh7和Sk-hep-1及表达Cherry的对照细胞,q PCR和Western blot检测NDRG2的表达情况;CCK8实验检测和比较上述细胞在正常培养和代谢应激情况下的细胞活力;克隆形成实验检测正常培养和缺糖应激下的克隆形成能力;流式细胞术和TUNEL染色检测细胞凋亡。2.分别用ATP检测试剂盒、NADP/NADPH定量比色试剂盒和DCFH-DA探针检测NDRG2过表达和对照肝癌细胞在正常培养和缺糖应激情况下的细胞内ATP水平、NADPH含量和NADP+/NADPH比值以及细胞内ROS水平。3.q PCR检测过表达NDRG2和对照肝癌细胞在正常培养和缺糖应激下脂肪酸氧化(FAO)关键调控分子的表达情况。给予PPARα的激活剂BEZA(400μM)和CPT1A的抑制剂ETO(100μM)后,分别用ATP检测试剂盒、NADP/NADPH定量比色试剂盒和CCK-8检测上述细胞在低糖应激下的细胞内ATP水平、NADPH含量以及细胞存活情况。4.Western blot检测NDRG2过表达肝癌细胞在正常和缺糖情况下AMPK/ACC通路的活化情况(p-AMPKα,AMPKα,p-ACC和ACC);在NDRG2过表达细胞Huh7中强行表达组成性活化的AMPKα,Western blot比较AMPK信号通路的活化情况,流式细胞术比较细胞凋亡。结果:1.CCK-8实验、克隆形成实验和凋亡检测结果表明,缺糖应激条件下过表达NDRG2抑制肝癌细胞存活,降低肝癌细胞的克隆形成能力,促进缺糖应激中肝癌细胞的凋亡。2.细胞内ATP、NADPH和ROS检测结果表明,过表达NDRG2降低缺糖应激条件下肝癌细胞内ATP和NADPH含量,升高NADP+/NADPH比值和细胞内ROS水平,过表达NDRG2加剧了缺糖应激下肝癌细胞能量和氧化还原失衡。3.NDRG2过表达可抑制缺糖应激诱导的脂肪酸氧化相关分子PPARα、CPT1A和ACADM的表达上调及脂肪酸氧化的活化。PPARα的激动剂BEZA可增加缺糖应激时NDRG2过表达肝癌细胞内ATP和NADPH含量,从而削弱缺糖时NDRG2对细胞存活的抑制作用。反之,CPT1A的抑制剂ETO则显著降低细胞ATP和NADPH含量,抑制缺糖应激下的细胞存活,该作用在对照细胞中比NDRG2过表达细胞更明显。4.NDRG2过表达可抑制缺糖应激条件下肝癌细胞中AMPK信号通路的活化;组成性活化的AMPK可逆转NDRG2对AMPK信号通路的抑制作用并部分缓解缺糖应激诱导的肝癌细胞凋亡。结论:缺糖应激条件下过表达NDRG2通过抑制肝癌细胞AMPK信号通路的活化,干扰脂肪酸氧化的激活,加剧肝癌细胞的能量耗竭和氧化应激并导致细胞凋亡,最终降低缺糖应激时肝癌细胞的存活能力。