研究背景和目的： 前列腺癌(Prostate cancer，PCa)是欧美国家最常见的男性恶性肿瘤，其死亡率仅次于肺癌居第二位。我国前列腺癌发病率近年来呈显著增长趋势。由于多数前列腺癌发病隐匿，早期临床症状轻微，当症状发生时多数已有局部浸润或远处转移，晚期PCa治疗效果欠佳。如何早期、准确的诊断前列腺癌以便早期及时治疗日益受到重视。通过实验室诊断技术，发现一些敏感性高、特异性强与PCa相关的指标诊断PCa是关注的焦点。 目前临床上应用最广泛的标记物前列腺特异性抗原(prostate—specific antigen，PSA)是一个组织特异性而非肿瘤特异性的标记物。前列腺特异性膜抗原(prostate—specific membrane antigen，PSMA)作为与前列腺癌密切相关的细胞跨膜蛋白，是近年来前列腺癌研究的热点。PSMA仅为人正常、恶性及转移灶的前列腺细胞所表达，具有很高的前列腺组织特异性。研究者发现PSMA在正常前列腺组织的表达很少，在前列腺增生及前列腺癌中表达增强，且尤以前列腺癌表达最高，逐渐认识到PSMA比PSA更具有特异性，并在研究过程中还发现它可用于早期诊断前列腺癌及其转移癌，以及前列腺癌术后的检测。 大量组织学研究结果证实了PSMA对于前列腺癌的高特异性，但血液学检测方面存在争议，因健康人中也可测到血清PSMA且随着年龄增长浓度升高，特别是50岁以后升高更明显，并且健康女性血清PSMA也随年龄增长而升高及乳腺癌患者血清PSMA水平增高，认为PSMA并非PCa的特异性生物标记，许多正常及疾病组织与血清PSMA水平相关。在肿瘤的早期阶段就有癌细胞进入血循环，运用高灵敏度的方法检测外周血中的PSMA mRNA的表达将有助于PCa血行播散的判断及早期诊断。RT—PCR法可检测出外周血中少量的mRNA，具有较高灵敏度，可用于PCa的早期诊断。这方面的研究同样存在争议，有许多研究证实PSMAmRNA检测的真实性和可靠性明显优于PSA，其特异性和敏感性更高，同样也有研究发现PSMAmRNA在健康人中的假阳性率达38％，认为在PCa的诊断中其临床效用低，需另行设计特异性引物及定量分析区分循环中的前列腺细胞。 PSMA存在可变剪接现象，通过可变剪接可以改变原有蛋白的功能，并且与肿瘤的发生发展、侵袭转移有关。PSM—E是前期在为进行基因重组PSMA前列腺癌疫苗的研究中，本研究组首次在世界上发现的一种PSMA新型剪接变异体，基因序列分析及编码蛋白预测分析表明，PSM—E不同于PSMA及目前已报导的其它剪接变异体，其基因序列编码的蛋白可能完全是一种新的细胞跨膜蛋白。而此前已发现的剪接变异体PSM’、PSM—C、PSM—D则均位于细胞浆，缺少蛋白质的跨膜区，属于非跨膜蛋白，缺乏PSMA原有的生物学功能及对前列腺癌诊断和治疗时的靶细胞定位作用。 前期研究中我们发现在肾、膀胱、十二指肠、回肠、肝癌及乳腺癌肿瘤组织中可检测到PSMA mRNA的转录物，但新剪接变异体PSM—E则仅在PCa和LNCaP中检测到，PSM—E仅表达于前列腺癌而在其它器官中缺如；PSM—E mRNA水平在正常前列腺、BPH和PCa间有显著性差异，并且PSM—E水平随Gleason评分一起升高。这证明PSM—E是一种较PSMA特异性更高的前列腺标记物，组织PSM—E mRNA表达水平可用于区分正常前列腺、前列腺增生和前列腺癌。 既往已有研究证实外周血PSMA检测对PCa的诊断较PSA特异性更高，那么对于剪接变异体PSM—E来说，PSM—E在PCa和BPH患者的外周血中是否表达？其表达水平是否如同组织学研究一样存在差异？能否通过高灵敏度的方法检测其差异而诊断PCa患者？这些都是本论文要研究的问题。 在此前我们的系列性相关研究基础成果上，本课题拟进一步研究外周血PSM—E检测分析在前列腺良、恶性疾病中的意义。因此，本研究根据获得的PSM—E编码区基因序列，制备PSM—E的真核表达质粒pcDNA3.0/PSM—E，根据PSM—E、PSMA、PSM’、PSM—C和PSM—D cDNA序列，设计PSM—E、PSMA特异性引物；定量分析PSM—E mRNA在正常对照、前列腺增生、前列腺癌患者外周血中的表达水平，并分析其差异，以证实PSM—E在前列腺癌患者外周血中的高表达特异性。为寻找前列腺癌灵敏和特异的诊断指标提供新的思路和理论依据。 方法： 1.PSM—E/PSMA的特异性引物及真核表达载体的制备： 前列腺癌组织中提取总RNA，逆转录合成cDNA。根据PSMA的基因序列设计含BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物，PCR扩增cDNA；PCR产物和真核表达载体pcDNA3.0分别经双酶切后凝胶回收纯化，T4连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α。挑选并鉴定氨苄青霉素抗性的阳性克隆增菌测序。提取LNCaP、PC—3细胞总RNA，逆转录合成cDNA。根据PSM—E、PSMA、PSM’、PSM—C和PSM—D结构序列特征设计PSM—E、PSMA特异性引物以区分其它剪接变异体，并构建PSM—E及PSMA的真核表达质粒(pcDNA3.0/PSM—E和pcDNA3.0/PSMA)。 2.PCA、BPH及正常对照者外周血PSM—E/PSMA荧光定量PCR检测及分析： 选取临床前列腺癌(n=53)、前列腺增生(n=79)患者及正常对照者(n=19)，提取其外周血有核细胞总RNA，逆转录合成cDNA。分别利用PSM—E、PSMA特异性引物，荧光定量PCR检测PSM—E、PSMA mRNA在正常对照、前列腺增生、前列腺癌患者外周血中的表达水平，以PSM—E/PSMA质粒作为检测标准品，以β—actin质粒作为内参进行校正，对检测结果统计分析其差异及探讨其临床意义。 结果： 1.成功制备PSM—E、PSMA的真核表达质粒(pcDNA3.0/PSM—E和pcDNA3.0/PSMA)及内参β—actin质粒，设计了PSM—E及PSMA的特异性引物； 2.外周血PSMA表达在PCa、BPH及正常对照三组间存在差异，方差分析跟独立样本t检验有统计学意义，PCa组的均值比正常组低同时比BPH组高。PSMA相对表达量在PCa组(-12.51±0.31)高于BPH组(-13.72±0.48)，差异有统计学意义，P<0.05。 3.外周血PSM—E表达在PCa、BPH及正常对照三组之间存在差异，方差分析跟独立样本t检验有统计学意义，PCa组的表达高于正常对照及BPH组。PSM—E相对表达量在PCa组(—8.22±0.32)高于BPH组(—9.99±0.41)，P<0.001。 4.PCa组内PSM—E表达高于PSMA，差值均数—4.29，P<0.001；BPH组内PSM—E表达同样高于PSMA，差值均数—3.73，P<0.001。组内PSMA与PSM—E相对表达量分别相关(r=0.36，p<0.05；r=0.65，p<0.01)，与血清PSA均不相关。ROC曲线分析表明PSME在诊断PCa的敏感性、特异性方面要优于PSMA。 结论： 1.PSMA的外周血表达在PCa、BPH及正常对照三组间存在差异，但PCa组的均值比正常组低同时比BPH组高。外周血PSMA检测可用于区分PCa和BPH患者，但不能作为单独的指标进行PCa的诊断，可作为一种辅助和补充手段应用。 2.PSM—E的外周血表达在PCa、BPH及正常对照三组间存在差异，在PCa组的表达高于正常对照及BPH组。外周血PSM—E检测可用于诊断PCa。 3.PSM—E在诊断PCa的敏感性、特异性方面要优于PSMA，PSM—E的检测灵敏度优于PSMA，可操作性更好。