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肺炎衣原体(Chlamydia pneumonia,Cpn)是一类严格活细胞内寄生的、具有独特生活周期的微生物。虽然肺炎衣原体的致病机制尚不清楚,但包涵体作为肺炎衣原体生物合成和代谢的重要场所,与肺炎衣原体的致病性密切相关。包涵体膜蛋白(inclusion protein,Inc)是包涵体的重要组成成分,是衣原体与宿主进行一系列信息和物质交换的基础,在肺炎衣原体的一系列生命活动中扮演重要角色。Cpn0147是已确定的肺炎衣原体包涵体膜蛋白之一,具有较强的免疫原性。本研究采用酵母双杂交技术对Cpn0147相互作用的蛋白质进行初步筛选,并采用免疫共沉淀和亚细胞共定位技术对筛选出的Cpn0147相互作用的蛋白质进一步验证。首先检测p GBKT7-Cpn0147诱饵质粒对酵母菌株AH109和Y187有无自激活和毒性作用。检测无自激活和毒性作用后,将诱饵质粒p GBKT7-Cpn0147转化的酵母菌株AH109与含有He La细胞c DNA文库的p GADT7转化的酵母菌株Y187进行酵母双杂交,当酵母结合子(三叶草或米奇结构)形成后,将该菌液涂布于腺嘌呤、组氨酸、亮氨酸、色氨酸营养缺陷型平板(SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp)进行初步筛选,收集经过三次筛选后的阳性菌落进行蓝白斑筛选,蓝斑菌落(阳性)进行PCR验证。选取PCR阳性的酵母菌落提取质粒转化大肠杆菌XL1-Blue后再提取质粒,然后分别转化酵母菌Y187后与p GBKT7-Cpn0147转化的AH109酵母菌进行回交实验,回交实验阳性的质粒进行碱基序列测定,测序结果在Genebank中进行BLAST检索比对确定其相互作用蛋白基因。酵母双杂交实验结果表明,Cpn0147与He La细胞c DNA文库中环腺苷酸应答原件结合蛋白3(CREB3)发生相互作用。为进一步验证Cpn0147与CREB3的相互作用,采用了亚细胞共定位技术与免疫共沉淀技术。运用脂质体转染试剂Lipo2000将pc DNA3.1+/His/Myc-Cpn0147和pc DNA3.1+/Flag-CREB3共转染至He La细胞。转染48 h后,一部分细胞经固定、封闭,然后加入兔抗c-Myc抗体、鼠抗Flag抗体,再经Alexa Fluor 488标记羊抗鼠Ig G抗体、Cy3标记羊抗兔Ig G抗体染色,激光共聚焦显微镜下观察。结果显示,c-Myc-Cpn0147呈现红色荧光,Flag-CREB3呈现绿色荧光,当二者有重叠时,呈现黄色荧光,初步证明Cpn0147可与重组CREB3结合;另一部分共转染的He La细胞裂解后离心,取上清经抗c-Myc agarose翻转吸附共沉淀后,进行SDS-PAGE电泳,转膜后进行封闭,再用兔抗c-Myc抗体和鼠抗Flag抗体进行孵育,洗膜后加入HRP标记羊抗兔Ig G、HRP标记羊抗鼠Ig G进行孵育。经ECL检测在分子量为16KD、45KD处显带,与c-Myc-Cpn0147、Flag-CREB3重组蛋白分子量相符,表明共转染的Cpn0147与CREB3结合。为进一步确认Cpn0147与内质网上CREB3的相互作用,同时进行下列实验:(1)将爬片24 h的He La细胞固定、封闭,再经鼠抗Calnexin抗体、兔抗CREB3抗体共同孵育,最后经Alexa Fluor 488标记羊抗小鼠Ig G抗体和Cy3标记羊抗兔Ig G抗体染色,激光共聚焦显微镜下观察;(2)用pc DNA3.1+/His/Myc-Cpn0147重组质粒转染He La细胞,转染48 h后,用鼠抗c-Myc抗体和兔抗CREB3抗体,已及对应的Alexa Fluor 488标记羊抗鼠Ig G抗体和Cy3标记羊抗兔Ig G抗体进行染色,激光共聚焦显微镜下观察;(3)用pc DNA3.1+/His/Myc质粒作为对照重复(2)。结果显示:当绿色荧光的Calnexin与红色荧光的CREB3重叠时,呈现黄色荧光;当绿色荧光的c-Myc-Cpn0147与内质网上红色荧光的CREB3重叠时,也有黄色荧光出现。证明Cpn0147可与内质网上的CREB3结合。本研究发现了肺炎衣原体包涵体膜蛋白Cpn0147可以与He La细胞CREB3相互作用,为进一步研究肺炎衣原体与宿主相互作用的分子机制打下基础。