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目的:本研究旨在通过TGF-β1诱导人血管内皮细胞内皮-间充质转化模型的建立,探讨HGF抑制人血管内皮细胞内皮-间充质转化的作用,以及Notch信号通路在此过程中可能的作用机制,以期寻找内皮-间充质转化可能的抑制方法,为内皮-间充质转化引起的血管疾病寻求可能的治疗靶点。方法:(1)TGF-β1诱导人脐静脉内皮细胞发生内皮-间充质转化模型的建立:用不同浓度的人TGF-β1蛋白作用于人脐静脉内皮细胞72小时,倒置显微镜观察细胞的形态学变化,提取细胞总RNA,RT-PCR检测内皮细胞标志物(CD31)及间充质细胞标志物(α-SMA、FSP1)的mRNA表达水平,根据结果选用浓度为10ng/ml的人TGF-β1蛋白进行后续实验。(2)c-Met siRNA转染人脐静脉内皮细胞沉默c-Met基因的模型建立:先用不同浓度的荧光标记siRNA转染人脐静脉内皮细胞,作用6小时后于荧光显微镜下观察每个浓度siRNA的转染效率,根据结果选用50nM的siRNA进行后续实验。再用不同片段的siRNA(001、002、003)转染人脐静脉内皮细胞,转染后作用72小时,RT-PCR检测c-Met mRNA表达水平,根据结果选用001号片段的siRNA进行后续实验。(3)实验分组及加样:实验分为4组:空白对照组(Ctr组)、TGF-β1组(T组)、TGF-β1+HGF组(T+H组)和TGF-β1+HGF+c-Met siRNA组(T+H+C/S组)。接种HUVECs于6孔板,完全培养基培养至细胞密度达30-40%,c-Met siRNA转染TGF-β1+HGF+c-Met siRNA组细胞6小时,各组细胞密度达60-70%时,更换为不含生长因子的培养基,并按分组加入相应人TGF-β1蛋白和HGF蛋白,使其终浓度均为10ng/ml,37℃、5%CO2的培养箱中培养72小时,于24、48、72小时倒置显微镜下观察各组细胞形态学变化。(4)Real-time PCR:按照实验各分组的要求完成细胞的相关处理,提取细胞总RNA,测定RNA浓度及纯度,逆转录RNA为cDNA,荧光定量PCR检测各组CD31、α-SMA、FSP1、RBP-J?的mRNA表达水平,结果进行统计分析;(5)Western Blotting实验:按照实验各组要求完成相关模型建立及药物干预,提取细胞总蛋白,BCA法测定蛋白浓度,依次完成制胶、加样、SDS-PAGE电泳、转模、脱脂牛奶封闭、4℃冰箱一抗孵育过夜、二抗孵育、ECL化学法曝光,Image J分析条带灰度值,结果进行统计分析。结果:(1)TGF-β1诱导人脐静脉内皮细胞发生内皮-间充质转化模型的建立:随着TGF-β1浓度的增加,CD31 mRNA的表达水平逐步下降,α-SMA和FSP1的mRNA表达水平逐步上升,其中在TGF-β1浓度为0-10ng/ml时,上述改变较为明显(P<0.05),随着浓度继续增加,各标志物的变化趋势较为缓和(P>0.05);浓度为10ng/ml的人TGF-β1蛋白作用于HUVECs后24小时,镜下未观察到明显的形态学变化,作用后48小时,细胞出现长梭形样的改变,作用72小时,细胞外形呈长梭形或纺锤形,发生形态学改变的细胞达70%以上。(2)c-Met siRNA转染HUVECs可有效抑制c-Met基因的表达,起到基因沉默的效果。(3)RT-PCR检测各组CD31、α-SMA、FSP1、RBP-J?的mRNA表达水平:T组CD31 mRNA的表达低于Ctr组(P<0.01),T+H组CD31 mRNA表达高于T组(P<0.01)和T+H+C/S组(P<0.01);T组α-SMA mRNA的表达高于Ctr组(P<0.05),T+H组α-SMA mRNA表达低于T组(P<0.05)和T+H+C/S组(P<0.01);T组FSP1 mRNA的表达高于Ctr组(P<0.05),T+H组FSP1 mRNA表达低于T组(P<0.01)和T+H+C/S组(P<0.01);T组RBP-J?mRNA的表达高于Ctr组(P<0.05),T+H组RBP-J?mRNA表达低于T组(P<0.05)和T+H+C/S组(P<0.01)。(4)Western Blotting检测CD31、α-SMA、RBP-J?的蛋白表达量:T组CD31蛋白表达低于Ctr组(P<0.01),T+H组CD31蛋白表达高于T组(P<0.01)和T+H+C/S组(P<0.01);T组α-SMA蛋白表达高于Ctr组(P<0.01),T+H组α-SMA蛋白表达低于T组(P<0.01)和T+H+C/S组(P<0.01);T组RBP-J?蛋白表达高于Ctr组(P<0.01),T+H组RBP-J?蛋白表达低于T组(P<0.01)和T+H+C/S组(P<0.01)。结论:(1)TGF-β1能有效诱导人脐静脉内皮细胞发生内皮-间充质转化(EndMT);(2)HGF能抑制TGF-β1诱导的内皮-间充质转化(EndMT);(3)Notch信号通路的激活参与了TGF-β1诱导的内皮-间充质转化的过程,HGF可通过下调Notch信号通路的信号转导来发挥抑制EndMT的作用。(4)该实验为EndMT相关血管疾病的治疗提供了可能的方向。