第一部分喉癌组织中环氧化酶-2(Cox-2)基因表达的实时定量PCR研究 目的：测定环氧化酶-2(Cox-2)mRNA在喉鳞癌组织中的含量，并分析环氧化酶-2(Cox-2)mRNA与喉鳞癌临床分期及组织分化程度的关系。 方法：用序列特异性引物和荧光染料SYBRGreenⅠ聚合酶链式反应(PCR)方法，检测25例原发性喉鳞癌和癌旁组织中Cox-2mRNA表达，采用GAPDH作对照。 结果：25份标本的扩增产物经熔解曲线分析及DNA琼脂糖凝胶电泳，证实扩增产物为Cox-2和GAPDH。Cox-2mRNA在喉鳞癌中的阳性率是100％，而在癌旁组织为48％(25例中12例阳性)，癌和癌旁组织的NCox分别为16.54±13.27、9.24±6.91，两者之间差异有显著性(t=2.438，P＜0.05)，且Cox-2mRNA在喉癌中的表达水平与其分化程度存在统计学联系，即临床分期Ⅰ期与Ⅱ期，Ⅱ期与Ⅲ/Ⅳ期差异有显著性。 结论：应用荧光染料SYBRGreenⅠ的实时定量PCR技术能够对Cox-2基因表达水平进行定量分析，Cox-2基因表达的上调与喉癌的发生有关，且可以作为一种有效的喉癌分子标志。 第二部分两种选择性环氧化酶-2抑制剂对喉癌Hep-2细胞生长抑制作用 目的：研究选择性环氧化酶-2抑制剂Sc-58125和Celecoxib对喉癌Hep-2细胞的生长抑制作用并探讨其作用机制。 方法：喉癌Hep-2细胞用含不同浓度Sc-58125和Celecoxib培养液培养24h，在倒置显微镜下观察细胞形态的改变，分别采用MTT法测定生长抑制率，DNA琼脂糖凝胶电泳法检测细胞凋亡，流式细胞仪检测凋亡率及细胞周期。 结果：经显微镜观察和MTT实验发现Sc-58125和Celecoxib均可抑制Hep-2细胞增殖；细胞周期结果显示：随着Sc-58125作用浓度的增加，处于G2/M期细胞数目增多；而随着Celecoxib作用浓度的增加，处于G0/G1期细胞数目增多，当浓度为50、100μmol/L时，出现明显凋亡。DNA琼脂糖凝胶电泳显示50、100μmol/LCelecoxib作用组出现DNA梯带，而Sc-58125作用组没有出现DNA梯带。 结论：两种选择性环氧化酶-2抑制剂Sc-58125和Celecoxib均可抑制Hep-2细胞体外增殖，改变细胞周期分布；且高浓度的Celecoxib可诱导Hep-2细胞凋亡。 第三部分选择性环氧化酶-2抑制剂Celecoxib体外诱导人类喉癌细胞(Hep-2)凋亡的分子机制 目的：研究选择性环氧化酶2抑制剂Celecoxib体外诱导人类喉癌细胞(Hep-2)凋亡的分子机制。 方法：经流式细胞仪、实时定量RT-PCR、免疫组化以及Western印迹法分别检测用100μmol/LCelecoxib培养液培养0、6、12和24h的喉癌Hep-2细胞中Cox-2、bcl-2基因表达水平及胞浆中Cox-2、细胞色素C和活性Caspase-3蛋白表达水平。 结果：①经流式细胞仪检测发现100μmol/LCelecoxib可诱导Hep-2细胞调亡，具有时间依赖性；②100μmol/LCelecoxib作用后，Hep-2细胞中Cox-2、bcl-2基因表达水平维持不变；③100μmol/LCelecoxib作用后，Hep-2细胞浆中Cox-2和bcl-2蛋白表达水平无任何改变；细胞色素C和活性Caspase-3蛋白表达水平逐渐增加，具有时间依赖性。 结论：①100μmol/LCelecoxib可诱导体外培养的人类喉癌细胞(Hep-2)凋亡；②药物诱导肿瘤细胞凋亡与Cox-2、bcl-2基因表达无关；③药物诱导肿瘤细胞凋亡可能是激活了一种新型的线粒体凋亡途径。 第四部分Celecoxib对人喉癌裸鼠移植瘤的抑制作用 目的：观察Celecoxib对人喉癌裸鼠移植瘤的抑制作用，探讨其抗肿瘤效应及可能的机理，寻找喉癌治疗的新靶点。 方法：建立人喉癌移植瘤裸鼠模型，用Celecoxib处理裸鼠，观察移植瘤的生长情况并绘制其生长曲线。用实时定量RT-PCR技术检测移植瘤中Cox-2和bcl-2mRNA表达情况，免疫组织化学技术检测Cox-2、bcl-2和Caspase-3。 结果：Celecoxib对人喉癌裸鼠移植瘤处理后用药组和对照组之间裸鼠的体重无明显差异(t值为0.017，P值大于0.05)，移植瘤中用药组肿瘤的体积较对照组均明显减小，t=7.75，P＜0.01，统计学上差异有显著性意义。在喉癌移植瘤中，用药组Cox-2和bcl-2mRNA或蛋白的表达较对照组无明显差异性(P值均大于0.05)；用药组Caspase-3蛋白的表达较对照组明显增加(P值均小于0.05)。 结论：Celecoxib在裸鼠体内能抑制肿瘤细胞生长，主要是通过激活了一种新型的线粒体凋亡途径诱导肿瘤细胞凋亡，从而抑制肿瘤细胞的生长和增殖。