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生殖细胞是遗传物质的传递者,人类和家畜优良性状的遗传都要通过生殖细胞来实现,因此生殖细胞的发生也就成为当前生殖生物学研究的热点之一。然而迄今为止,我们对生殖细胞发育和分化的了解还知之甚少,而干细胞为研究生殖细胞的发育提供了极为有利的工具。骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)是一群存在于骨髓中具有不断增殖和自我更新能力的成体干细胞,已在多个物种证明该类干细胞具有体外分化为3个胚层诸多细胞类型的能力,可见BMSCs在分化潜能上几乎可以与ES细胞相媲美。但与ES细胞相比,BMSCs具有取材方便、体外易培养、增殖快和免疫原性低等优点,是生殖细胞发育分化和基因表达调控的理想种子细胞之一。因此,本试验以体外分离培养的山羊BMSCs作为细胞模型,研究不同的外源因子(视黄酸RA和骨形态蛋白BMP4)和内源因子(DAZL基因)诱导BMSCs向早期生殖细胞发生转分化,为研究哺乳动物生殖细胞的发生及机理建立可靠的模型。本研究共分为三个部分,第一部分为RA和BMP4体外诱导山羊BMSCs向早期生殖细胞分化；第二部分为过表达DAZL基因体外诱导山羊BMSCs向早期生殖细胞分化；第三部分为山羊早期生殖细胞报告载体pVASA-GFP的构建。主要的试验结果如下：1.通过不同浓度的RA(0.01,0.1,0.5,1,5,10,50uM)和BMP4 (0.01,0.1,1,5,25,50, and 100 ng/ml)处理山羊BMSCs,通过两个生殖细胞特异性基因MVH和DAZL的表达来确定最佳RA和BMP4的浓度。结果显示,当BMP4达到25 ng/ml时,MVH和DA ZL在mRNA水平明显上调；当RA的浓度达到1μM时,MVH和DAZL在mRNA水平显著升高。因此确定BMP4和RA的最优浓度分别为25ng/m1和1μM。然后,分别用1μM RA,25ng/m BMP4和1μM RA+25ng/ml BMP4三个处理组诱导山羊BMSCs.诱导前后形态学结果显示：RA和RA+BMP4组大部分细胞由梭形变为圆形,且圆形细胞的核质比升高,但BMP4组的细胞没有呈现明显的变化。RT-PCR结果显示,三组均能诱导表达MVH、DAZL、C-KIT、NANOG、STELLA和OCT4,但是只有RA和RA+BMP4组能够表达STRA8、SCP3、PIWIL2和RNF17。本试验利用BMP4和RA成功诱导山羊BMSCs向生殖细胞发生了转分化,表达了生殖细胞特异性相关标记,为后续向减数分裂后期生殖细胞分化奠定了基础。2.通过传统的质粒方法和体外mRNA合成的方法来过表达DAZL基因,诱导山羊BMSCs向生殖细胞分化。将RA处理的细胞作为对照,比较外源因子和内源因子的转分化的效率。结果表明：1OAZL ml RNA的表达水平均显著上升,MVH mRNA的表达水平均有上调,但是mRNA的诱导方法使MVH mRNA水平显著上升；SCP3表达也有升高但是差异不显著。为验证结果,我们进一步通过免疫荧光技术检测了蛋白水平的表达。结果也表明DAZL和MVH的蛋白水平均有上调,但通过荧光强度发现mRNA的方法较有效。此外,为进一步阐明DAZL在山羊BMSCs体外向生殖细胞转分化过程中的作用,本试验对RA处理的山羊BMSCs进行DAZL基因干扰试验,结果显示：所构建的4个干扰载体均能明显下调DAZL和MVH mRNA水平的表达,SCP3的mRNA水平在SH2和SH3干扰后明显降低,NANOG的mRNA水平在SH2和SH4干扰后明显升高。免疫荧光结果分析表明,1OAZL和MVH在蛋白水平均呈现明显下调。本试验说明DAZL基因在生殖细胞的分化中起着重要作用。3.通过PCR方法克隆了1044bp的山羊VASA基因的5’非编码区和部分的编码区,将该序列亚克隆至pEGFP-Nl载体,经酶切和PCR鉴定表明所构建的pVASA-EGFP重组质粒是成功的。将构建好的pVASA-EGFP的载体进一步转染入用RA诱导4d的BMSCs,转染48h后观察到绿色荧光蛋白的表达,该载体的成功构建为体外生殖细胞的分化和示踪提供很好的方法。