自交不亲和性(Self-incompatibility,SI)是一种“钥匙和锁"形式防止开花植物自交的机制,研究比较深入的甘蓝等芸薹属植物的自交不亲和反应从S基因座的两个基因相互识别开始,雄性决定因子SCR(Slocuscysteine-richprotein)与雌性决定因子SRK(Slocusproteinkinase)两个因子的相互识别,相同单倍型的花粉的信号由柱头乳突细胞外传至胞内,THL与SRK相分离并释放至细胞质中,SRK的激酶域随后激活ARC1(Armrepeatcontaining),进一步将自交不亲和信号传至EX070A1,再通过后续的级联反应,最终导致自交不亲和。　　 本研究利用酵母双杂交系统研究甘蓝自交不亲和反应中S位点受体激酶(SRK)的激酶域与ARC1间的相互作用。以羽衣甘蓝2003a和结球甘蓝E1为材料,利用PCR技术分别分离出羽衣甘蓝的ARC1和结球甘蓝的SRKJ(S位点受体激酶激酶结构域);构建以pGBKT7为载体的ARC1a、ARC1b、ARC1c和ARC1d的重组诱饵质粒;以pGADT7为载体的SRKJ的重组猎物载体,进行了相互作用验证,研究结果为芸薹属植物自交不亲和反应的分子机理提供新内容。　　 1.序列的克隆分析　　 ①所克隆的羽衣甘蓝ARC1的基因序列长度为1992bp且不含内含子,与已报道甘蓝的ARC1的cDNA序列具有99.7%的相似度,二者编码的蛋白质序列仅有4个位点的氨基酸差异;②所得的羽衣甘蓝的ARC1基因编码的蛋白质没有信号肽,氨基酸序列存在6个磷酸化位点;;③所得的ARC1基因与甘蓝型油菜ARC1的cDNA序列相似度达到99.4%,二者编码的蛋白质在一级结构上的一致性高达到92.9%,存在45个位点的氨基酸差异。④对蛋白的序列分析发现ARC1包含U-box和5个连续重复ARM两个重要的区域,经Blast与VectorNTI分析发现:羽衣甘蓝与甘蓝型油菜U-box区存在5个位点的氨基酸差异,ARM区域有14个位点的氨基酸差异。结球甘蓝的SRK激酶域与羽衣甘蓝SRK激酶域的氨基酸序列的相似性达到91.0%,376个氨基酸序列中存在46个差异氨基酸,而这46个差异氨基酸中有12个为相似性氨基酸。SRK激酶域氨基酸序列存在一个高变区,高变区位于序列第250个氨基酸与270个氨基酸之间。　　 2.酵母双杂交重组诱饵质粒的毒性及自激活检测　　 Y2HGold[pGBKT7-ARC1a]、Y2HGold[pGBKT7-ARC1b]、Y2HGold[pGBKT7-ARC1c]、Y2HGold[pGBKT7-ARC1d]、Y2HGold[pGBKT7-ARC1a]和Y2HGold[pGBKT7]转化株在缺陷型SD/-Trp平板上生长状态良好,并且菌斑大小无明显差异;由此表明构建的4组重组诱饵质粒的表达对酵母细胞无毒性作用。另外,pGBKT7-ARC1四个实验组在缺陷型SD/-Trp、SD/-Trp/x-a-gal平板上均能生长、在SD/-Trp/x-a-gal/AbA平板上不生长,其中在SD/-Trp/x-a-gal平板上生长的菌落无明显蓝色出现,说明四个实验组在酵母细胞中没有自激活现象。　　 3.酵母双杂交重组猎物质粒的毒性检测　　 将pGADT7空载和pGADT7-SRKJ转化Y187,发现空载和重组表达载体在SD/-Leu平板上生长状态良好,由此表明重组表达质粒pGADT7-ARC1成功转入酵母细胞Y187且无毒性作用。　　 4.相互作用检测　　 三个实验组Y2HGold[pGBKT7-ARC1a]×Y187[pGADT7-SRKJ]、Y2HGold[pGBKT7-ARC1c]×Y187[pGADT7-SRKJ]、Y2HGold[pGBKT7-ARCld]×Y187[pGADT7-SRKJ]同时激活了4种报告基因AUR1-C、MEL1、HIS3、ADE2;表明羽衣甘蓝ARC1与结球甘蓝的SRK激酶结构域能够发生相互作用,且互作的区域位于连续的臂重复区,其与结球甘蓝ARC1的氨基酸差异不足以引起互作区的正确构象改变。研究结果为芸薹属植物自交不亲和反应的分子机理提供新内容。