论文部分内容阅读
1.目的基于复方龙芩草在抗病毒感染方面的作用优势及微乳载药体系对多种中药复方活性成分的增溶及捕集作用,课题组前期利用生物相溶性微乳(Microemulsion, ME)为溶剂对复方龙芩草进行提取,制备出复方龙芩草微乳提取液(Microemulsion extract of compound Longqincao, MLQC)并分析提取液中的主要成分。本课题在此基础上,运用MTT法检验MLQC的抗H1N1流感病毒的效果；以抗病毒效果为指标,挖掘MLQC中具有抗病毒作用的主要活性成分；利用均匀设计法优化主要活性成分配比,阐明发挥药效的物质基础；采用网络药理学方法分析MLQC抗H1N1流感病毒作用的分子机制。2.方法2.1 MLQC抗H1N1流感病毒作用研究以ME作为溶剂提取复方龙芩草,得到复方龙芩草微乳提取液,即MLQC。运用MTT法检测ME和MLQC对A549细胞的毒性,采用细胞病变效应(CPE)、抑制率(ER)及治疗指数(TI)表示药物对病毒致细胞病变作用的影响。2.2 MLQC中主要成分抗H1N1流感病毒作用研究初步探究MLQC中主要成分黄芩苷、甘草苷、天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸分别抗H1N1流感病毒的效果,通过计算细胞病变效应(CPE)、病变抑制率(ER)和治疗指数(TI)判断药物对病毒致细胞病变作用的影响,寻找出微乳提取液中发挥抗H1N1流感病毒效果的有效成分。2.3 MLQC主要成分组方优化及药效物质基础研究对2.2筛选出的MLQC中主要有效成分进行均匀实验设计,通过等值线图,分析各成分对抗病毒效果的贡献大小、影响及各有效成分之间的相互作用,阐释MLQC中发挥抗病毒作用的物质基础；建立数学模型得出各因素之间的回归方程,筛选出具有最佳抗病毒效果的活性成分配比,并对抗病毒效果进行实验验证。2.4 MLQC抗流感病毒作用分子机制研究运用网络药理学的研究手段,通过数据库检索出复方龙芩草化学成分、各化学成分对应的靶点,及与抗病毒作用相关的基因、蛋白靶点,以此构建ME及MLQC的化学成分-蛋白-靶点网络,分析有效成分与药物靶点之间的相关性,以主要作用靶点为基础,找出药物抗流感病毒相关的免疫信号传导途径,初步分析MLQC的抗病毒作用机制。3.结果3.1 MLQC抗H1N1流感病毒作用MLQC体外抗H1N1流感病毒的效果显著,当浓度为1250μg/mL(以含ME量计)时,抗病毒效率达到91.373±1.055%,IC5o为314.808μg/mL,TI为20.889。ME具有一定的抗流感病毒的效果,当浓度为1250μg/mL(以含ME量计)时,对病毒致细胞病变的抑制率为67.573±2.628%,IC50为769.178μg/mL,TI为9.078。3.2 MLQC中主要成分抗H1N1流感病毒作用前期分析结果表明,MLQC中主要成分为黄芩苷、甘草苷、天冬氨酸、谷氨酸和亮氨酸。黄芩苷抗病毒作用显著,甘草苷有一定的效果,三种氨基酸单独作用于细胞,在最大的溶解浓度下对细胞几乎没有毒性,能改变细胞的形态,几乎没有抗H1N1流感病毒的效果。初步检验黄芩苷对A549细胞的TC50为166.59μg/mL,当浓度为50μg/mL时,抗病毒效率达87.810±1.905%,IC50为4.313μg/mL, TI为38.63。甘草苷浓度为25μg/mL时的抗病毒效率为52.959±4.650%,IC50为20.464μg/mL,TI为4.15。3.3 MLQC主要成分组方优化及药效物质基础通过回归方程和等值线图分析,对抗病毒效果影响较大的是X2(黄芩苷),其次是X1(甘草苷),X5(谷氨酸)也有一定的影响,其中黄芩苷和甘草苷,天冬氨酸和亮氨酸,黄芩苷、亮氨酸和天冬氨酸之间还存在交互作用。甘草苷、天冬氨酸含量不变时,抗病毒效率随着黄芩苷浓度的增加而变大,而亮氨酸在抗病毒效率中表现出负相关性。经均匀设计实验优化,当甘草苷：黄芩苷：亮氨酸：天冬氨酸：谷氨酸的含量比例为0.11：0.40：1.8：10：20时,抗病毒效果最佳,经验证可达到85.34±4.72%。3.4 MLQC抗流感病毒作用分子机制ME的四个组成成分(胆固醇、卵磷脂、胆盐、肉豆蔻酸异丙酯)‘及MLQC中60种化学成分可以通过直接或间接作用在病毒靶点上发挥抗病毒作用。微乳中胆固醇、卵磷脂可通过其节点蛋白激活部分Toll样受体间接抑制流感病毒致细胞的病变。MLQC中包含黄芩苷、甘草苷、天冬氨酸、谷氨酸和亮氨酸在内的超过40个化学分子与3个以上的靶点存在较强的交互作用,这些靶点分布在病毒的复制、免疫信号转导等环节,可以推测这些分子在MLQC抗病毒治疗中占据较为关键的地位；从复方网络中富集出38个与流感作用于人体相关的主要节点,这些节点分别参与免疫应答调节的信号转导,Toll样受体信号传导途径等9条信号传导途径,表明MLQC微乳抗H1N1流感病毒的机制可能是通过调控先天性免疫应答如Toll样,(MyD88依赖途径)、JAK-STAT、NF-κB等途径,激活TLRs,MAPKs,促进调节性细胞因子的分泌,降低炎性因子的表达,最终达到抑制H1N1流感病毒复制、转染的目的。4.结论MLQC有显著的抗H1N1流感病毒的作用,ME在一定程度上起到辅助作用。复方中主要成分黄芩苷抗病毒效果显著,甘草苷有一定的效果,但作用不显著,三种氨基酸单独作用没有明显的抗病毒效果,但与其他成分存在交互作用,对抗病毒效果有一定的影响。MLQC中对抗病毒效果贡献最大的为X2(黄芩苷),其次是X1(甘草苷),X5(谷氨酸)也有一定的作用。各成分存在交互作用,每一个成分对抗病毒作用都有一定的影响。具有最佳抗病毒效果的成分组合及含量比例为甘草苷：黄芩苷：亮氨酸：天冬氨酸：谷氨酸(0.11：0.40：1.8：10：20),提示MLQC发挥抗H1N1流感病毒的效果并不是由单一成分决定的,而是由多种成分综合作用的结果。MLQC发挥抗H1N1流感病毒的作用机制,可能与先天性免疫调控Toll样受体信号传导、JAK-STAT等途径有关,通过各个通路激活相关免疫因子,调控最终细胞因子的表达水平发挥抗H1N1流感病毒的作用。