米面制品因含有丰富的营养物质和充足的水分,是许多腐败菌及致病菌的天然培养基,其中金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,以下简称“S.aureus”)和大肠杆菌O157(Escherichia coli O157),沙门氏菌(Salmonella)及乳杆菌(Lactobacillus)是其常见的污染菌株,目前对该类食品微生物检测手段主要通过国家标准法,检测程序繁琐,耗时较长。相关研究表明这四种细菌在一定的环境条件下可进入VBNC状态,从而成功逃避国家“金标准”检测,同时,VBNC状态的细菌仍保留其致毒与腐败特性,造成潜在的食品安全隐患,因此对其在食品体系中控制消减具有重要的意义。此外,目前对细菌VBNC状态形成的条件的研究大多集中特定环境,了解米面食品微生物进入VBNC状态的关键条件是消除其污染的关键。鉴于此,本研究的主要目的是通过建立一种快速检测手段,实现对米面食品主要微生物及其VBNC状态的检测。同时,选取米面食品中常见的金葡菌及大肠杆菌O157为研究对象,研究外界环境条件对其VBNC状态形成的影响,获得其进入VBNC状态的关键条件。通过获得的关键条件探究改变相应的环境对其VBNC状态形成的抑制效果,并进一步在食品体系中进行VBNC状态的消除措施的验证。1.以大肠杆菌O157的rfbE保守区域设计反应引物,建立并优化PSR反应体系。在甜菜碱浓度为0.7 M,氯化锰的浓度比为1:4或1:8时,能够通过显色反应判读结果。在靶序列的合适区域设计加速引物IF与IB,在反应时间为40 min时可发生明显的颜色反应。对优化的PSR扩增反应进行了特异性与灵敏度分析,结果表明针对rfbE设计的引物具有高度的特异性,所构建的反应体系用来检测大肠杆菌O157:H7的检测限为11.2pg/μL,优化的PSR技术比传统PCR技术的灵敏度高10倍。2.以金葡菌,沙门氏菌及乳杆菌特异基因的保守区域设计相应的引物,使用优化的PSR扩增体系,对建立的PSR方法的特异性与灵敏度进行评价。采用人工模拟上述四种细菌污染水晶饼食品体系并进行DNA提取,使用构建的PSR体系显色法及电泳法均可实现对其快速及高灵敏度的检测,PSR技术检测水晶饼食品体系中上述四种菌株的的检出限分别为10~3 CFU/mL、10~4 CFU/mL、10~5 CFU/mL、10~4 CFU/mL,PSR技术用于食品体系微生物检测的灵敏度未受到食品组分的影响。3.选取米面食品中常见的金葡菌及大肠杆菌O157为研究对象,在冷冻(-20℃)寡营养环境条件下两者可进入VBNC状态。以5μg/mL浓度的PMA处理结合PSR扩增技术应用于VBNC状态的金葡菌、大肠杆菌O157及膜损伤菌的检测,仅VBNC状态的菌株的反应体系颜色由橙黄色变为绿色,而死亡菌株模板DNA仍为橙黄色。同时,对PMA-PSR反应体系应用与VBNC菌株检测的灵敏度进行评价,PMA-PSR检测VBNC状态的金葡菌O157的检测限为10~3 CFU/mL,检测VBNC状态的金葡菌检测限为10~4CFU/mL。采用人工模拟VBNC状态的金葡菌及大肠杆菌O157污染水晶饼,检测限与纯诱导液一致。4.以金葡菌ATCC25923及大肠杆菌O157 ATCC43895为研究对象,在低温条件下,不同环境因素,包括营养状态、酸度、盐浓度,对进入VBNC状态的影响。发现金葡菌形成VBNC状态的关键环境条件为:ⅰ营养充足强酸性环境(4℃储藏)ⅱ营养不足的弱酸性环境(冷藏环境)Ⅲ寡营养冷冻环境(-20℃)。E.coli O157进入VBNC状态关键环境条件为:ⅰ富营养高盐环境ⅱ营养物质充足高盐弱酸环境ⅲ寡营养冷冻环境。5.外界环境条件对金葡菌形成VBNC的影响大小为:营养状态>酸度>盐浓度。外界环境条件对大肠杆菌O157形成VBNC状态的影响效果为:酸度>营养状态>盐浓度。环境因素对不同菌株VBNC状态形成的影响效果不同,菌株自身的生理特性能否进入VBNC状态的因素有着十分重要的影响,因此对于控制其形成需要依据菌株的特点及对环境的抗性。6.在有营养物质条件通过体积分数为1.0%的乙酸处理对金葡菌VBNC状态的消除效果不显著,结合营养状态对金葡菌形成VBNC状态具有很明显影响,对金葡菌VBNC状态的消减最优的方式为:无营养物质供给并提供一定的酸性环境。在营养物质浓度高于50%时,添加体积分数为1.0%的乙酸处理可直接使大肠杆菌O157死亡,达到对其VBNC状态形成的消除。在弱酸高盐环境条件下,通过改变营养状态,可达到控制大肠杆菌O157 VBNC状态的形成。食品体系中在营养物质浓度为25%,50%及100%时,添加体积分数为1.0%的乙酸,在3d内金葡菌及大肠杆菌O157细菌已经死亡,实现了在米面食品体系中金葡菌及大肠杆菌O157的VBNC状态的消除。