论文部分内容阅读
用于骨修复的组织工程支架需要有较大的表面积、合适的孔隙率和孔尺寸、高度互连的多孔结构,从而可以支持细胞粘附和增殖,还需要具备可以调控和介导细胞活性的能力。本研究通过冷冻干燥法制备壳聚糖(CS)/双相磷酸钙陶瓷(BCP)复合支架。其中,CS不但可以用于支架成形,还可以可促进骨细胞粘附;BCP具有羟基磷灰石(HA)的生物活性和β磷酸三钙(β-TCP)的可降解特性,进一步提高支架的骨诱导性。然后在支架表面同时接枝精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸三肽(RGD)和装载骨形态发生蛋白(BMP-2)纳米颗粒,促进细胞的增殖和分化。首先,利用冷冻干燥法制备CS与BCP质量比为8:0、8:1、4:1、2:1的复合支架。通过SEM观察支架微观结构,结果表明多孔支架孔径约为10 μm,BCP颗粒在支架中分散均匀。体外细胞培养表明,CS和BCP质量比为4/1时,能有效促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)的增殖和向成骨细胞的分化。其次,通过两种方式将RGD接枝在CS/BCP复合支架表面。一种是将海藻酸钠(ALG)邻二羟基氧化成醛基,通过醛基与RGD的氨基发生希夫碱反应,得到RGD接枝的氧化海藻酸钠(OALG-RGD),并进一步通过希夫碱反应,将OALG-RGD固定在支架表面。另外一种是EDC/NHS反应,将RGD末端的羧基活化,与支架表面暴露的CS的氨基反应,从而将RGD接枝在支架表面。考察不同浓度RGD在复合支架表面的接枝率以及对BMSCs形态,增殖和分化的影响。结果表明,采用第一种方法时,当RGD溶液浓度为1 μg/ml时,支架表面浓度为2.3 nmol/cm2,有利于BMSCs在支架表面的粘附,增殖和向成骨细胞分化。而通过第二种方法,当RGD溶液浓度为度为100 μg/ml,支架表面浓度为60.1 nmol/cm2时最优,RGD浓度太低或太高都不利于细胞活性。最后,将骨生长因子BMP-2和牛血清蛋白BSA混合溶液通过去溶剂法形成包裹BMP-2的纳米颗粒。将CS和OALG层层组装在颗粒表面形成BSA+CS+OALG纳米颗粒,最外层的OALG的醛基与CS的氨基共价结合,从而将纳米颗粒负载到CS/BCP支架上,有效地保护了生长因子的活性并且实现生长因子缓释。通过BMSCs的培养实验,表明RGD和BMP-2在促进细胞粘附,增殖和分化有一定的协同作用。动物实验结果表明同时接枝RGD和装载BMP-2纳米颗粒的支架具有一定的骨修复能力。