论文部分内容阅读
磷酸化是一种常见的蛋白质翻译后修饰,在植物病毒侵染过程中发挥重要作用。病毒的复制酶、运动蛋白、外壳蛋白和病毒编码的RNA沉默抑制子(viral suppressor of RNA silencing,VSR)被磷酸化后都可以调节病毒的侵染和致病性。大麦条纹花叶病毒(Barly striosaic virus,BSMV)是一种ss(+)RNA病毒,它编码的γb蛋白在植物防御和病毒反防御的军备竞赛中具有多重功能,但γb蛋白是否存在磷酸化修饰及其对病毒侵染和寄主响应的影响并不清楚。本研究分析了γb蛋白磷酸化的生物学功能,并对本生烟激酶STY46通过与γb蛋白互作负调控BSMV侵染的分子机制进行了初步分析。本研究首先利用丝氨酸磷酸化特异抗体(anti-phosphoserine)检测到BSMVI γb蛋白在受侵染的植物体内存在磷酸化修饰,经体外磷酸化实验和质谱分析,证明γb蛋白可以被本生烟中类PKA蛋白激酶磷酸化,Ser-96是其主要的磷酸化位点。γb蛋白非磷酸化突变体病毒(BSMVS96A和BSMVS96R)诱导双子叶植物和单子叶植物产生细胞坏死反应,病株中的病毒积累量减少,而模拟磷酸化突变体病毒BSMVS96D的致病症状与野生型病毒一致,说明γb的磷酸化状态影响了 BSMV的致病性和病毒积累量。γb蛋白非磷酸化突变体S96A的VSR活性显著减弱,而模拟磷酸化突变体S96D的VSR活性与野生型γb相当。γb蛋白的磷酸化状态不影响其自身互作和多聚化能力,但磷酸化化后可增强其结合21 nt siRNA的能力。这些结果表明,γb蛋白被PKA磷酸化是其发挥VSR活性进而抑制寄主RNA沉默所必需的。除抑制植物RNA沉默外,γb蛋白被PKA磷酸化还能够抑制寄主的细胞坏死反应。利用瞬时表达、转基因植株组成型表达和通过γb缺陷型病毒(BSMV△γb)侵染表达等实验,证明来源于其它病毒的RNA沉默抑制子均不能抑制BSMVS96A引起的细胞坏死反应,只有回补正常功能的Yb蛋白才能有抑制作用。证明磷酸化的γb蛋白对植物细胞坏死反应的抑制独立于其VSR活性,这两种抑制作用在功能上是相互独立的。因此,γb在Ser-96被PKA磷酸化对于维持病毒持续侵染和寄主适度反应的平衡至关重要。除此之外,还发现BSMV yb蛋白与本生烟激酶NbSTY46在体内和体外直接互作,γb的BM结构域(aa 19-47)和STY46激酶家族的保守氨基酸Thr-436分别是互作的关键区和关键氨基酸。NbSTY46的Thr-436突变为A(T436A)后,不仅其自磷酸化活性丧失,而且既不能与γb互作也不能将γb磷酸化。BSMV侵染不影响NbSTY46表达水平,也不改变其亚细胞定位。瞬时表达和转基因组成型超表达NbSYT46激酶均抑制病毒的侵染和复制,而通过转基因下调本生烟NbSYT46的表达可加重BSMV的症状,增加病毒积累量,且NbSTY46对病毒侵染的负调节依赖其激酶活性。超表达NbSTY46不影响γb的VSR活性,但竞争性BiFC的初步结果暗示NbSTY46有可能抑制γb蛋白与复制酶αa的互作。上述研究结果表明,自磷酸化的本生烟激酶NbSYT46通过与γb直接互作并将其磷酸化负调节BSMV的复制,进而抑制BSMV的侵染。这些研究结果为阐明病毒蛋白磷酸化如何平衡病毒的持续侵染和寄主的适度反应,以及植物激酶蛋白在病毒与寄主互作中的防御功能提供了新的科学证据。