背景:课题前期研究发现虎耳草的乙醇提取物、丙酮提取物和正己烷提取物对黄色葡萄球菌均表现出了很强的抗菌活性（抑菌圈直径在20-30mm）,随后用活性最强的虎耳草乙醇提取物对（人、家禽、马、兔、猪等）不同种源的多重耐药金葡菌菌株（耐甲氧西林、青霉素、林可酰胺、氨基糖苷、四环素等）进行了测试,预实验结果显示虎耳草70%乙醇提取物对所有菌株的最小抑菌浓度（MIC）均低于10 mg·mL-1,提示其具有良好的抗菌活性,且拮抗金黄色葡萄球菌的作用机制可能有别于前述抗生素。随着细菌的不断进化,抗生素耐药已成为临床上细菌感染治疗面临的棘手问题,近年来耐甲氧西林（MRSA）甚至耐万古霉素金黄色葡萄球菌所致病例的日渐增多,开发不同作用机制的抗生素具有重要的现实意义,前期研究基础显示中药虎耳草可能具有全新的抗菌作用机制,故而,本课题对虎耳草抗金黄色葡萄球菌作用的物质基础、作用机制进行研究。目的:分离、分析出虎耳草主要化学成分,研究虎耳草抗菌活性的物质基础;探究虎耳草抗金黄色葡萄球菌的作用机制与靶标,阐明虎耳草定向诱导的金黄色葡萄球菌耐药株的耐药机制和关键蛋白。方法:1、采用液相色谱质谱联用法,检测虎耳草70%乙醇提取物中的化学成分,筛选出相对含量较高的主要化合物。2、通过天然产物分离、纯化,质谱、核磁共振波谱鉴定手段分离获取虎耳草主要化学成分。3、采用扩散法和微量稀释法对虎耳草进行体外抗菌实验研究,验证虎耳草醇提物的抗金黄色葡萄球菌活性,并明确虎耳草对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度。采用MIC逐步诱导方法,以逐步提升给药浓度方式,诱导培育定向耐药的金黄色葡萄球菌菌株,并对耐药菌株和敏感菌株的生长曲线进行测定。4、对金黄色葡萄球菌的耐药菌株和敏感菌株进行蛋白质组学分析,包括蛋白功能注释、差异表达蛋白分析、GO和KEGG通路富集分析,并筛选出潜在抗菌蛋白、耐药蛋白。结果:1、液相色谱质谱联用分析虎耳草化学成分,共获得40张成分质谱图,明确鉴定其中24个成分,其余谱图以同分异构体形式存在,尚未确定具体结构。发现岩白菜素的质谱峰响应值远远高于其他成分。2、利用柱色谱法对虎耳草70%提取物进行分离、纯化,共获得10个化合物,鉴定为山奈酚、木犀草素、槲皮素、原儿茶酸、岩白菜素、槲皮素-5-O-β-D-葡萄糖苷、金丝桃苷、槲皮苷、异槲皮苷、芦丁。其中8个为黄酮类、1个苯丙素类和1个酚酸类。3、体外抗菌实验结果显示,虎耳草70%醇提物的抗菌活性较强,其791.81 mg·mL-1溶液抑菌圈为25±0.25mm,对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为1.54 mg·mL-1。MIC逐步诱导方法培育出对虎耳草耐药的金黄色葡萄球菌耐药株,同等浓度下其抑菌圈缩小为5±0.06 mm,虎耳草的最低抑菌浓度上升到395.9 mg·mL-1。相比起敏感菌株,其对虎耳草的耐受性增加了 257倍。4、对金黄色葡萄球菌的耐药株和敏感株进行蛋白质组学研究,发现了差异表达蛋白125个,其中上调表达蛋白83,下调表达蛋白有42个。其中与虎耳草抗菌、耐药株耐药相关的关键蛋白为ebh、clpB、ldhl、pdxB、sbnB、sspP、isd B、HMPREF0769-10780、sbi、δ-hemolysin、Efb、dltA 和 MprF 等 13 个蛋白。KEGG通路富集分析说明虎耳草发挥抗金黄色葡萄球菌的通路:金黄色葡萄球菌感染通路、拮抗阳离子抗菌肽通路;耐药菌耐药通路为双组份系统通路。结论:虎耳草化学成分复杂繁多,其主要化学成分为岩白菜素及黄酮类化合物,为虎耳草的药理活性研究提供药效物质基础支持;通过MIC逐步诱导法成功培育出对虎耳草定向耐药的金黄色葡萄球菌;蛋白质组学研究对虎耳草敏感的金葡菌及耐药金葡菌,发现了虎耳草抗金葡菌相关的抗菌蛋白5个,耐药性相关蛋白8个,为虎耳草的抗菌作用机制的深入研究提供思路和参考。