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目的检测人永生化食管上皮细胞(Shantou Human Embryonic Esophageal Epithelial cell line,SHEE)及其恶变细胞(Shantou Human Embryonic Esophageal Carcinoma Epithelial cell line,SHEEC)中核干细胞因子(Nucleostemin,NS)和磷脂肌醇3‐激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(phosphninositide 3-kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin,PI3K/AKT/mTOR)信号转导通路中关键因子PI3K、AKT、mTOR的表达水平。然后利用RNA干扰(RNAi)技术沉默癌细胞SHEEC中NS基因的表达,探讨NS基因下调后对PI3K/AKT/mTOR信号转导通路中相关分子表达的影响,检测抑制NS基因后对SHEEC细胞凋亡和增殖的影响,初步探索NS基因在食管癌发生发展过程中的作用及其对PI3K/AKT/mTOR信号转导通路的影响。方法1.SHEE和SHEEC细胞连续传代培养,取对数生长期细胞,分别提取RNA和蛋白,然后采用Real-time PCR和Western Blot方法检测SHEE及SHEEC细胞中NS基因和PI3K/AKT/mTOR信号转导通路中关键因子PI3K、AKT、mTOR mRNA和蛋白的表达水平。2.利用RNAi技术沉默SHEEC细胞中NS基因的表达,用倒置荧光显微镜和流式细胞仪检测转染6h后的转染效率,RT-PCR检测转染24h后NS基因的表达水平并计算其抑制率。3.转染24h和48h以后,分别用RT-PCR和Western Blot方法检测SHEEC细胞中NS表达下调后PI3K/AKT/mTOR信号通路中关键因子mRNA和蛋白水平的表达变化。4.流式细胞仪和MTT方法分别检测干扰NS基因前后SHEEC细胞凋亡率和增殖活性的变化。5.采用SPSS 21.0统计软件中的t检验和方差分析对实验结果进行分析,数据用X±S表示,检验水准为α=0.05。结果1.癌细胞SHEEC中NS、PI3K、AKT、mTOR和GβL mRNA的表达量均显著高于正常细胞SHEE,分别为SHEE细胞的2.047±0.507、2.13±0.262、1.614±0.256、2.072±0.746和2.00±0.432倍,差异有统计学意义(P<0.05);NS、PI3K和p-AKT蛋白在SHEEC细胞中的表达也显著高于SHEE细胞,差异有统计学意义(P<0.05)。2.转染细胞6h后,荧光显微镜下观察到NS-RNAi成功转染至SHEEC细胞中,流式细胞仪检测转染效率为87.18%,RT-PCR检测NS基因在SHEEC细胞中的表达水平明显下调,NS的抑制率约为47.8%。3.RT-PCR结果显示,抑制SHEEC细胞中NS基因的表达后PI3K、AKT、mTOR和GβL mRNA的表达均明显下降,NS-RNAi组与SHEEC组、NC组和MOCK组比较差异均有统计学意义(P<0.05);Western Blot结果显示,抑制SHEEC细胞中NS基因的表达后PI3K和p-AKT基因的蛋白表达量为0.353±0.361和0.312±0068,与SHEEC组、NC组和MOCK组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。4.NS-RNAi组细胞凋亡率显著高于SHEEC组、Mock组和NC组(35.487±1.631 vs.0.227±0.114、6.683±0.486、11.580±2.24,P<0.05);NS-RNAi组与SHEEC组、Mock组、NC组和GAPDH组比较,细胞增殖能力显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论1.NS和PI3K/AKT/mTOR信号转导通路中关键因子在SHEEC细胞中高表达,在SHEE细胞中低表达。2.抑制SHEEC细胞中NS基因的表达后NS与PI3K/AKT/mTOR信号转导通路中关键因子的表达均明显下降,PI3K/AKT/mTOR信号通路可能是NS发挥作用的一种非依赖p53作用的信号途径。3.抑制NS基因的表达可以明显降低SHEEC细胞增殖能力,促进细胞的凋亡,表明NS可能与肿瘤细胞的恶性增殖和凋亡逃逸密切相关。