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膀胱癌是最为常见的泌尿系统恶性肿瘤之一,目前其发病率正逐年上升。膀胱癌在男性所有恶性肿瘤中排名第四,在女性中排名第十位。根据细胞的生物学特征,膀胱癌可分为肌层浸润型膀胱癌与非肌层浸润型膀胱癌两大类,其中以非肌层浸润型膀胱癌居多。膀胱癌患者早期死亡率不高,一旦出现侵袭、转移死亡率会明显升高。研究显示,在膀胱癌诊断时已经有1/3患者发生转移或者局部浸润,因此,寻找一种能够使我们进一步了解膀胱癌发展、转移的分子标记物迫在眉睫。miRNA是一类非编码RNA,长度约为10-22核苷酸,在人类基因组中约有2000多种。其可通过3’ UTR结合区域与靶基因信使结合,降解靶基因或抑制靶基因的翻译,进而调控基因水平、调控细胞生长、分化。大量研究表明,miRNAs的异常表达与癌症相关,其表达变化可引起胃癌、肝癌、乳腺癌、甲状腺癌、肺癌等多种肿瘤性疾病的发生发展。有研究表明,在膀胱癌中,miRNA也存在表达差异。miRNA可以通过多种途径调控膀胱癌细胞的凋亡、增殖、转移等,对其深入研究,有望发现膀胱癌诊断及治疗的新的临床靶点。miR-618是miRNA家族成员之一,已有多种研究表明,miR-618可通过调节TGF-β2、CBX8信号通路、PI3K/Akt通路,转移foxp2、调控TIMP-1的表达等参与胃癌、肝癌、乳腺癌、甲状腺癌、肺癌等多种肿瘤性疾病的发生发展。但是miRNA-618在膀胱癌中的作用,国内外相关研究报道尚少。本课题旨在观察膀胱癌组织及细胞中miR-618的表达变化情况及miR-618的表达变化对膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭等生物学行为的影响,阐明miR-618对膀胱癌发展的作用及其可能的分子机制。本学位论文由以下三部分组成:第一部分miR-618在膀胱癌中的表达特点目的:研究膀胱癌组织及细胞系中miR-618的表达变化。方法:收集膀胱癌患者的膀胱癌组织及其配对癌旁组织;体外培养膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1及HTB-9等膀胱癌细胞系,应用Real-time PCR方法检测膀胱癌组织及细胞中miR-618较对照组的表达变化。结果:1.miR-618在膀胱癌组织中表达较其配对正常癌旁组织明显升高我们应用Real-time PCR检测了所收集的膀胱癌组织及其配对的正常癌旁组织中miR-618的表达情况。结果显示,miR-618在膀胱癌组织中表达水平明显高于其配对的癌旁正常组织中的表达水平。2.miR-618在膀胱癌细胞中表达明显升高我们以人膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1为正常对照组,HTB-9、CCC-HB-2等膀胱癌细胞系为实验组,应用Real-time PCR检测了所有细胞中miR-618的表达情况。结果显示,miR-618在膀胱癌细胞中的表达高于正常膀胱上皮细胞。结论:miR-618于膀胱癌组织及HTB-9等膀胱癌细胞系中表达水平增多。第二部分miR-618促进膀胱癌细胞的增殖、迁移、侵袭及上皮间充质转化目的:研究升高和敲低miR-618表达对膀胱癌细胞增殖、侵袭及迁移等生物学行为的影响作用和对膀胱癌细胞发生EMT的影响作用。方法:将人工合成的miR-618正义序列(miR-618 mimics)及反义序列(miR-618 inhibitor)转染入膀胱癌细胞系中,以建立miR-618过表达和低表达的膀胱癌细胞系。应用real-time PCR方法检测miR-618表达情况,应用CCK-8、平板克隆实验等方法检测miR-618表达改变后膀胱癌细胞的活性及增殖能力变化。应用细胞划痕实验检测miR-618表达改变后膀胱癌细胞迁移能力的变化。应用transwell小室实验检测miR-618表达改变后膀胱癌细胞侵袭能力的变化。应用细胞免疫荧光实验、westernblotting实验检测miR-618表达改变后膀胱癌细胞中E-cadherin、N-cadherin、vimentin、snail等蛋白的表达变化,以观察膀胱癌细胞EMT发生的变化情况。结果:1.成功建立miR-618过表达及低表达的膀胱癌细胞株将miR-618 mimics,miR-618 inhibitor转染入膀胱癌细胞系中,增强或抑制了miR-618的表达,成功在膀胱癌细胞系中过表达及抑制了 miR-618表达。2.上调miR-618表达可促进膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭等生物学行为①利用CCK-8法检测细胞活性,结果显示出,在同一检测时间点内,转染miR-618 mimics的膀胱癌细胞的细胞活力较转染mimics-NC的细胞明显增高。②平板克隆实验法检测细胞增殖,结果显示出,转染miR-618 mimics的膀胱癌细胞细胞集落数明显高于转染mimic-NC的细胞。③应用创伤愈合实验评估细胞迁移行为,结果显示出,转染mimic-618组的膀胱癌细胞划痕愈合较mimic-NC组划痕愈合明显增快。④应用transwell小室实验评估细胞侵袭行为,结果显示出,转染mimic-618组的膀胱癌细胞侵袭能力较mimic-NC组明显增快。⑤通过应用裸鼠体内的肿瘤增殖实验,评估肿瘤细胞体内的增殖行为,结果显示出,mimic-618组的小鼠体内肿瘤增长速度较mimic-NC组明显增快。这些数据说明,上调miR-618表达可促进膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭等生物学行为。3.敲低miR-618表达可抑制膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭等生物学行为①利用CCK-8法检测细胞活性,结果显示,在同一检测时间点内,转染miR-618 inhibitor的膀胱癌细胞的细胞活力较转染inhibitor-NC的细胞明显减弱。②平板克隆实验法检测细胞增殖,结果显示,转染miR-618 inhibitor的膀胱癌细胞细胞集落数明显少于转染inhibitor-NC的细胞。③应用创伤愈合实验评估细胞迁移行为,结果显示,转染inhibitor-618组的膀胱癌细胞划痕愈合较inhibitor-NC组划痕愈合明显减慢。④应用transwell小室实验评估细胞侵袭行为,结果显示,转染inhibitor-618组的膀胱癌细胞侵袭能力较inhibitor-NC组明显减慢。这些数据说明,敲低miR-618表达可抑制膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭等生物学行为。4.miR-618表达变化可影响EMT的发生①细胞免疫荧光染色检测E-cadherin、vimentin蛋白的表达,结果显示,转染mimic-618的膀胱癌细胞中E-cadherin的表达较转染mimic-NC的膀胱癌细胞明显下降,而Vimentin蛋白的表达较转染mimic-NC的膀胱癌细胞明显增多。反之,转染inhibitor-618的膀胱癌细胞中E-cadherin的表达较转染inhibitor-NC的膀胱癌细胞明显上升,而Vimentin蛋白的表达较转染inhibitor-NC的膀胱癌细胞明显下降。②Westernblotting方法检测E-cadherin、N-cadherin、Snail蛋白表达情况,结果显示,转染mimic-618的膀胱癌细胞中E-cadherin的表达较转染mimic-NC的膀胱癌细胞明显下降,而N-cadherin和Snail蛋白的表达较转染mimic-NC的膀胱癌细胞明显增多。反之,转染inhibitor-618的膀胱癌细胞中E-cadherin的表达较转染inhibitor-NC的膀胱癌细胞明显上升,而N-cadherin和Snail蛋白的表达较转染inhibitor-NC的膀胱癌细胞明显下降。5.miR-618通过促进EMT的发生促进膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭应用EMT抑制剂抑制膀胱癌细胞EMT的发生后,再次分别应用mimic-618及mimic-NC转染该膀胱癌细胞,与转染mimic-NC的膀胱癌细胞相比,转染mimic-618的膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭能力无明显比变化。该结果提示,miR-618通过促进EMT发生来促进膀胱癌细胞的增殖、迁徙及转移等生物学行为。结论:升高miR-618表达,可以促进膀胱癌细胞的增殖、侵袭、迁移及上皮间充质转化的发生。反之,抑制miR-618表达可抑制膀胱癌细胞的增殖、侵袭、迁移及上皮间充质转化的发生。miR-618通过促进EMT的发生促进膀胱癌细胞增殖、侵袭、迁移。第三部分miR-618通过TGF-β1/Smad通路促进EMT发生目的:探究miR-618促进膀胱癌发展的分子机制。方法:应用RNA沉淀(pulldown)技术及液质联质谱分析(liquidchromatography-mass spectrometry,LC-MS)寻找miR-618在膀胱癌细胞中特异结合的蛋白。应用Western Blotting及Real-time PCR实验检测目标蛋白及EMT发生过程中关键蛋白的变化情况。结果:1.miR-618在膀胱癌细胞中可与TGF-β1特异结合RNA pull down实验得到miR-618及考马斯亮蓝染色,发现与对照组蛋白溶液相比,miR-618组蛋白溶液中存在特异的蛋白条带。应用质谱分析方法检测发现miR-618可与TGF-β1特异结合。对TGF-βl进一步研究,Western Blotting及RIP实验进一步证实miR-618与TGF-β1特异结合。这些数据表明,miR-618可与TGF-β1特异结合。2.miR-618促进TGF-β1蛋白的分泌2.1上调miR-618表达可促进TGF-β1蛋白分泌Western Blotting 及 Real-time PCR 结果显示,上调 miR-618 表达不影响 TGF-β1蛋白的表达。ELISA结果显示,上调miR-618表达可促进TGF-β1蛋白分泌。这些数据表明,上调miR-618表达可促进TGF-β1蛋白分泌。2.2敲低miR-618表达可抑制TGF-β1蛋白分泌Western Blotting 及 Real-time PCR 结果显示,敲低 miR-618 表达不影响 TGF-β1蛋白的表达,ELISA结果显示,敲低miR-618表达可抑制TGF-β1蛋白的分泌。这些数据表明,敲低miR-618表达可抑制TGF-β1蛋白分泌。3.上调miR-618表达可通过TGF-β/Smad通路诱导EMT发生Western Blotting结果显示,上调miR-618表达后,膀胱癌细胞中Smad蛋白表达增多,E-cad蛋白表达减少,N-cad及Snail蛋白表达增多。上述实验结果表明,miR-618表达可通过TGF-β/Smad通路诱导EMT发生。结论:miR-618可通过与TGF-β1特异结合,促进EMT发生,以促进膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭。