Protein4.2(P4.2或band4.2)是人红细胞膜上重要的周围膜蛋白，在每个红细胞上约有200,000个拷贝，约占红细胞膜上蛋白质总量的5﹪。P4.2基因位于人第15号染色体的q15区段，长度大约为20Kb，含有的13个外显子编码了691个氨基酸，其理论分子量为76,841Da。 P4.2能够与带3蛋白(band3)，ankyrin以及spectrin直接相互作用，P4.2还能与Protein4.1，CD47等结合，将Rh复合体结合到红细胞的细胞骨架网络中。 Band3是人红细胞膜上最重要的蛋白质之一，它的胞质段(cdb3)与细胞骨架蛋白ankyrin、protein4.1和protein4.2等相互作用，调控细胞膜和细胞骨架之间相互作用；Ankyrin通过与band3及spectrin的作用，将细胞骨架固定在脂膜双分子层上。 P4.2的重要性日益受到关注，因为研究表明P4.2的缺失可以导致明显的红血球溶血、贫血症以及各种的遗传性球形红细胞症和遗传性椭球形红细胞增多症。遗传性球形红细胞增多症(hereditaryspherocytosis，HS)的主要症状是球形红细胞增多，这些球形红细胞相对于双凹型红细胞而言，其渗透性增强，在机械力作用下更容易破碎，最终导致溶血性的贫血。HS主要和红细胞膜上的带3蛋白、protein4.2、spectrin和ankyrin的异常有关。 人红细胞的形状维持和可变性是由蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白质-脂质相三者之间的相互作用模式共同实现的，在红细胞中，细胞膜骨架包含有两个方向上面的相互作用方式，垂直方向的band3-ankyrin-spectrin相互作用和水平方向的spectrin-protein4.1-actin相互作用。P4.2也参与细胞膜骨架的相互作用，但是它的确切功能未知。作为红细胞膜上最晚被表达的蛋白质之一，我们对它的了解很少，它是如何行使生理功能?它与膜上最重要的蛋白质band3和ankyrin发生相互作用，这三者之间的相互作用模式又是如何的? 为了研究P4.2的确切生理功能以及与band3、ankyrin三者之间的相互作用模式，我们首先建立了可靠的invitro实验系统。我们尝试通过分子生物学的方法，从人肝cDNA中克隆了P4.2的全长序列，并在大肠杆菌中大量表达重组的P4.2蛋白，但发觉全长P4.2蛋白的表达不佳，这可能与P4.2包含有一个疏水性较强的区段有关。通过葡萄球菌V8蛋白酶和溴化氰对P4.2蛋白的限制性酶切分析，我们选取了一系列序列重叠的P4.2片段进行克隆表达。我们成功地表达了8种含有不同融合接头的重组P4.2片段蛋白：GST-P4.2(31-200)、GST-P4.2(187-260)、GST-P4.2(155-211)、GST-P4.2(155-260)、GST-P4.2(34-185)、GST-P4.2(100-211)、GST-P4.2(100-260)和Trx-P4.2(1-300)。我们还克隆表达了GST-cdb3、His6-cdb3、GST-ankyrinD34和Trx-ankyrinD34这四种重组蛋白。经过优化表达条件，并通过离子交换层析、亲和层析和分子筛纯化，我们得到了较纯的各种重组蛋白。通过SDS-PAGE和Westernblot，验证了各种重组蛋白。 随后通过Far-Westernblot和Pull-downassay实验，我们发现P4.2的第31-200位氨基酸片段是与ankyrin可能的直接相互作用区段，而且很可能是在第187-200位氨基酸区段；P4.2与cdb3的相互作用区段精确到第201-211位氨基酸。 由于目前为止共有9种P4.2基因突变可以导致遗传性球形红细胞增多症，其中4种错义突变特别引起了我们的注意。通过对比P4.2的三维结构模拟图，发现发生突变的第175位氨基酸残基恰好位于连接P4.2的两个结构域domainl和domain2的区段上，所以我们预测第175位氨基酸残基的突变可能导致P4.2不能与ankyrin结合。于是我们采用了点突变的方法，克隆表达了4种重组的突变蛋白GST-P4.2(31-200)D175Y、GST-P4.2(31-200)D175Y、GST-P4.2(100-260)D175Y，GST-P4.2(31-200)A142T，发现第175位氨基酸残基的突变使得相应的重组蛋白均不能与ankyrin直接相互作用，而第142位氨基酸残基的突变对P4.2与ankyrin之间的相互作用没有影响，这说明第175位氨基酸对于P4.2与ankyrin的结合是非常重要的，很可能是一个关键位点。 为了进一步研究第175氨基酸残基突变对相互作用产生影响的模式，我们根据第175位氨基酸由D(Asp)突变为Y(Tyr)，设计了相应的3种氨基酸残基突变，分别是D(Asp)突变为K(Lys)、F(Phe)和A(Ala)。通过Far-Westernblot和Pull-downassay，我们发现GST-P4.2(31-200)D175K能够与ankyrin直接相互作用，而其它两种突变蛋白GST-P4.2(31-200)D175F和GST-P4.2(31-200)D175A均不能与ankyrin直接结合。 因此，我们认为，在Protein4.2Komatsu中，第175位氨基酸残基由带负电荷的天冬氨酸突变为非极性的带芳香环的酪氨酸，由于电荷效应的改变引起了P4.2蛋白的domainl和domain2之间的空间结构发生变化，导致了P4.2与ankyrin之间不能结合，破坏了ankyrin-P4.2-band3三者之间的相互作用，使得膜骨架结构不能很好地被提呈到膜上，或者说导致膜骨架结构的稳定性下降，从而不能继续维持红细胞的双凹圆盘形状，红细胞变为球形。其渗透性增强，在机械力作用下更容易破碎，最终导致溶血性的贫血。