重复侵染排斥(Superinfection exclusion)或同源排斥(Homologous interference)是指已经成功侵染的病毒能够排斥相同或者亲缘关系相近的病毒再次侵染的现象。重复侵染排斥现象在动物病毒和植物病毒中广泛存在,在农业生产中常用来防治某些植物病毒的危害,即预先接种了病毒温和株系的作物可以抵抗或者减轻与之亲源关系相近的强毒株系的侵染和危害,因此又被称为交义保护(Cross protection)。白1929年重复侵染排斥现象被发现以来,很多研究报道试图解释这一现象,但到目前为l止其分子机制尚不清楚。芜菁皱缩病毒(Turnip crinkle virus, TCV)是番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)麝香石竹斑驳病毒属(Carmovirus)成员,属ss(+) RNA病毒,基因组大小为4054nt,可以系统侵染拟南芥、本生烟等植物。在本研究中,采用TCV和拟南芥侵染体系,尝试分析了TCV不同突变体病毒之间重复侵染排斥的分子机理。为了探究TCV在侵染拟南芥过程中重复侵染排斥现象的分子机理,在TCV外壳蛋白编码框终止密码子之后分别整合9段不同的21nt核苷酸片段,构建了TCV病毒的9种突变体病毒。将这9种TCV突变体病毒重复侵染野生型和dcl2/dcl4突变株拟南芥,实验结果表明在TCV不同突变体侵染过程中存在着重复侵染排斥现象,而基因沉默机制并不是TCV突变体之间重复侵染排斥的主要原因。TCV和碎米荠褪绿斑点病毒(CCFV).香石竹斑驳病毒(CarMV)进行的重复侵染实验证明,TCV与亲缘关系近的CCFV病毒之间也存在着重复侵染排斥现象,但不排斥同源关系较远的CarMV。为了进一步明确TCV不同突变体病毒之间重复侵染排斥的关键蛋白,将瞬时表达TCV编码的各个蛋白的农杆菌与含TCV-GFP重组病毒的农杆菌混合后注射本生烟,结果证明TCV复制酶小亚基P28蛋白能够抑制TCV病毒的复制。进一步的实验证明,P28蛋白能够在植物细胞内形成大聚合物并排斥了TCV病毒的侵染,但瞬时表达的P28蛋白并不影响TCV病毒正常表达自己的复制酶小亚基。利用两种不同启动子分别瞬时表达P28GFP蛋白和P28Mcherry蛋白,证明P28具有捕获不同来源P28单体并形成聚合体的功能,这表明P28蛋白很可能是通过捕获TCV病毒表达的复制酶小亚基,使其不能发挥作用,从而抑制TCV病毒的复制。通过半变性SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳实验,证明TCV复制酶小亚基P28在病毒侵染过程中也能够形成大的聚合物,这进一步佐证了P28蛋白是TCV重复侵染排斥现象的关键蛋白,在TCV侵染过程中存在两种不同的状态,其形成的不具有复制能力的聚合体能够捕捉二次侵染的TCV表达的P28,导致其无法进行复制。综上所述,TCV突变体之间存在重复侵染排斥,复制酶小亚基P28是这种重复侵染排斥的关键蛋白,通过形成聚合物捕捉二次侵染的TCV表达的P28排斥其侵染。甜菜黑色焦枯病毒(Beet black scorch virus, BBSV)是番茄丛矮病毒科坏死病毒属(Necrovirus)成员,也是ss (+) RNA病毒,基因组大小为3644nt。本实验室前期的研究证明,BBSV外壳蛋白(Coat protein, CP)能够定位于细胞核,N末端4KRNKGGKKSR13碱性氨基酸富集区是其细胞核定位信号,对这些碱性氨基酸的突变会影响BBSV病毒粒体的形成以及其在本生烟中的系统运动。为了深入研究外壳蛋白N末端碱性氨基酸在BBSV侵染过程中的功能,针对这些碱性氨基酸进行了一系列的点突变和缺失突变,并对这些突变体病毒的复制能力、病毒粒体稳定性和系统运动能力进行了检测。通过本生烟原生质体侵染实验,证明在外壳蛋白N末端引入的突变并不显著影响BBSV基因组RNA的复制和外壳蛋白的表达。通过纯化这些突变体的病毒粒体和进行RNase保护实验,证明这些突变体病毒粒体的形成和稳定性都不同程度的降低,说明外壳蛋白N末端的碱性氨基酸参与了BBSV病毒粒体装配和稳定性。外壳蛋白和基因组RNA体外结合实验显示,N末端的碱性氨基酸与病毒基因组RNA的结合有关,其中4KR5为关键氨基酸。通过侵染性实验,证明这些包装缺失突变体病毒系统侵染本生烟的能力也受到不同程度的影响。综上所述,BBSV外壳蛋白N末端的碱性氨基酸不仅是核定位信号,还是外壳蛋白和基因组RNA结合的关键区域,也影响BBSV病毒粒体的装配和稳定性,BBSV系统侵染本生烟需要完整的和稳定的病毒粒体。