木瓜蛋白酶膜结晶的实验研究

来源 :北京化工大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:aolongjiutian
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X-射线晶体衍射分析在分子生物学中起着非常重要的作用,因此需要有适合做衍射分析的蛋白质晶体。然而,生物大分子的许多特性不同于有机和无机的小分子,例如:静电学性质、较复杂的形状及物理化学不稳定性等等,这就使生物大分子的结晶过程变得较为复杂。因此,获得质量完美的蛋白质晶体成为蛋白质结构测定的主要瓶颈,需要探索新的结晶方法以制备蛋白质等生物大分子晶体。用膜结晶技术结晶蛋白质可得到适合于衍射分析的大分子蛋白质晶体。首先本文采用聚丙烯中空纤维微孔膜对木瓜蛋白酶的静态膜结晶过程进行了沉淀剂的选择和优化,评价了不同温度和膜面积下的溶剂跨膜通量。结果表明:对于木瓜蛋白酶的渗透膜结晶,在以pH值4.7的醋酸盐缓冲溶液和25%的氯化镁溶液作为洗脱液条件下,磷酸铵(NH43PO4可作为结晶过程的优良沉淀剂,在适当的浓度(2%)和温度(15℃)范围,能够制备出较完美的木瓜蛋白酶晶体。然后使用聚偏氟乙烯(PVDF)中空纤维膜对木瓜蛋白酶进行动态渗透膜结晶实验研究。考察了不同蛋白质溶液浓度、洗脱液浓度、温度、膜面积以及料液流速对木瓜蛋白酶动态渗透膜结晶的影响,并进行不同料液流速下蛋白质晶体尺寸分布的分析,最后通过显微镜照相、红外波谱对晶体进行分析。结果表明:在以pH 4.7的0.1 mol/L醋酸钠为缓冲溶液,1%的(NH43PO4为沉淀剂的条件下,木瓜蛋白酶较为合适的结晶条件为:木瓜蛋白酶的浓度为30mg/mL,洗脱液氯化镁溶液的浓度为25%,温度控制在15℃,动态膜结晶膜组件膜面积为62.83cm2。当对不同流速进行考察时,发现蛋白质溶液和洗脱液流速分别控制在4744μm/s和1.37×104μm/s的高流速时,有效面积为62.83cm2的动态膜组件的效率可得到较好的发挥,并制得尺寸较大的木瓜蛋白酶晶体。通过显微镜照相、红外分析以及晶体尺寸分布分析表明,在最优条件下,晶体尺寸可达到0.5mm,能够满足蛋白质衍射分析的需要。最后,本文采用聚丙烯中空纤维微孔膜对牛血清白蛋白V进行静态膜结晶研究,考察了不同沉淀剂类型和浓度对牛血清白蛋白V静态渗透膜结晶的影响,并进行了沉淀剂的选择和优化。结果表明:酒石酸钾钠可作为结晶过程的优良沉淀剂,在适当浓度(2%)下能够制备质量出较好的牛血清白蛋白V晶体。
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