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背景在心肌缺血/再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury,IRI)的基础研究中,应用的模型包括在体心脏模型、离体心脏模型和离体心肌细胞模型。关于采用在体和离体心脏构建再灌注损伤模型的方法,目前已开展了许多研究并获得了确切的结论。但是,采用离体心肌细胞构建再灌注损伤模型的方法则多种多样,而且既往相关文献中所用的细胞类型、刺激环境和刺激时间等亦各不相同。该实验旨在对既往文献中常用的12种模拟在体心肌IRI的离体心肌细胞模型的可行性进行系统评价,以确定这些离体模型是否能够成功模拟在体心肌IRI的某些特征,从而可用于该领域的相关研究。本实验分为三个部分:第一部分:探究12种常用建模方法下单独模拟缺血和模拟缺血/再灌注的心肌细胞生存情况本部分实验是对乳大鼠和H9c2心肌细胞分别实施模拟缺血(simulated ischemia,SI)处理和模拟缺血/再灌注(simulated ischemia-reperfusion,SIR)处理,观察心肌细胞在SI处理和SIR处理下的形态学改变、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放情况和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)水平,判定模拟再灌注(simulated reperfusion,SR)处理是否可对遭受SI处理的心肌细胞造成进一步的损伤。根据实验目的,对于每种模型,将乳大鼠和H9c2心肌细胞随机分成:①对照(control,C)组,细胞正常培养;②SI处理组,对细胞实施SI处理;③SIR处理组,对细胞实施SI处理后再实施SR处理。在模型1～10,设置5个不同的SI处理时间,即3 h、6 h、9 h、12 h和15 h。在模型11和12,设置4个不同的SI处理时间,即15 min、30 min、45 min和60 min。各组干预结束后,检测心肌细胞形态学改变、LDH释放情况和ATP水平。结果显示,首先,在模型1～12,SI处理导致乳大鼠和H9c2心肌细胞损伤形态学表现,而且形态学损伤表现随SI处理时间延长而明显加重,但随后实施SR处理未导致心肌细胞损伤形态学表现进一步的恶化。其次,在模型1、2、3、4、5、7、8、9和10,SI处理导致乳大鼠和H9c2心肌细胞LDH释放率明显增加(与C组相比,全部P值<0.05),LDH释放率随SI处理时间延长而升高,但随后实施SR处理则未导致心肌细胞LDH释放率进一步升高,反而明显降低(与相应的SI组相比,全部P值<0.05);在模型6,SI处理导致乳大鼠和H9c2心肌细胞LDH释放率较正常时有所增加(与C组相比,P值<0.05),虽然与正常时比较差异具有显著统计学意义,但增加幅度不像其他模型那么明显,而且心肌细胞LDH释放率亦未随SI处理时间延长而进一步升高,随后实施SR处理也未导致心肌细胞LDH释放率进一步升高;在模型11和12,SI处理均未导致乳大鼠和H9c2心肌细胞LDH释放率明显增加,甚至与正常时比较明显降低(与C组相比,P<0.05),但随后实施SR处理则导致心肌细胞LDH释放率明显升高(与相应的SI组相比,全部P值<0.05)。最后,在模型1～12,SI处理导致乳大鼠和H9c2心肌细胞ATP水平均明显降低(与C组相比,全部P值<0.05),ATP降低的程度随SI处理时间延长而加重,但随后实施SR处理则使心肌细胞ATP水平恢复(与相应的SI组相比,全部P值<0.05)。第二部分:探究12种常用建模方法下单独模拟缺血和模拟缺血/再灌注的心肌细胞损伤特征本部分实验旨在观察SI处理和SIR处理下乳大鼠和H9c2心肌细胞损伤的特征,判断SIR处理造成的损伤是否具有在体心肌IRI的某些病理生理特征。根据实验目的,对于每种模型均将乳大鼠和H9c2心肌细胞随机分成:①C组,细胞正常培养;②SI处理组,对细胞实施SI处理;③SIR-0.5h处理组,对细胞实施SI处理后再实施SR处理0.5 h。在模型1～10,SI处理时间为6 h;在模型11和12,SI处理时间为30 min。在各组干预结束后,检测心肌细胞活性氧物质(reactive oxygen species,ROS)水平、Ca2+离子水平、炎症细胞因子水平和线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)水平。结果显示,对于乳大鼠心肌细胞,在模型1～12,SI组ROS水平与C组比较均明显升高(全部P值<0.05)。在模型1、2、3、4、5、7、8、9和10,SIR-0.5h组ROS水平与相应的SI组比较均明显降低(全部P值<0.05);在模型6、11和12,SIR-0.5h组ROS水平与相应的SI组比较差异均无显著统计学意义(全部P值>0.05)。对于H9c2心肌细胞,在模型1、2、3、8、9、10、11和12,SI组ROS水平与C组比较均明显升高(全部P值<0.05);而在模型4、5、6和7,SI组ROS水平与C组比较均明显降低(全部P值<0.05)。在模型3、8、9、10、11和12,SIR-0.5h组ROS水平与相应的SI组比较均明显降低(全部P值<0.05);在模型4、5和6,SIR-0.5h组ROS水平与相应的SI组比较均明显升高(全部P值<0.05);在模型1、2和7,SIR-0.5h组ROS水平与相应的SI组比较差异均无显著统计学意义(全部P值>0.05)。对于乳大鼠心肌细胞,在模型1、2、3、4、5、7、8、9、10、11和12,SI组Ca2+离子水平与C组比较均明显升高(全部P值<0.05);在模型6,SI组Ca2+离子水平与C组比较差异无显著统计学意义(P值>0.05)。在模型11和12,SIR-0.5h组Ca2+离子水平与相应的SI组比较均明显降低(全部P值<0.05);在模型1、2、3、4、5、6、7、8、9和10,SIR-0.5h组Ca2+离子水平与相应的SI组比较差异均无显著统计学意义(全部P值>0.05)。对于H9c2心肌细胞,在模型1、2、3、7、8、9、10、11和12,SI组Ca2+离子水平与C组比较均明显升高(全部P值<0.05);在模型4、5和6,SI组Ca2+离子水平与C组比较差异均无显著统计学意义(全部P值>0.05)。在模型11,SIR-0.5h组Ca2+离子水平与相应的SI组比较明显降低(P<0.05);在模型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和12,SIR-0.5h组Ca2+离子水平与相应的SI组比较差异均无显著统计学意义(全部 P 值>0.05)。对于分离培养的乳大鼠和H9c2心肌细胞,培养上清液中几乎无炎症细胞因子;对心肌细胞实施SI和SIR处理亦未导致明显的炎症细胞因子生成。对于乳大鼠心肌细胞,在模型1～12,SI组MMP水平与C组比较均明显降低(全部P值<0.05)。在模型6和9,SIR-0.5h组MMP水平与相应的SI组比较均明显升高(全部P值<0.05);在模型1、2、3、4、5、7、8、10、11和12,SIR-0.5h组MMP水平与相应的SI组比较差异均无显著统计学意义(全部P值>0.05)。对于 H9c2 心肌细胞,在模型 1、2、3、7、8、9、10、11 和 12,SI组MMP水平与C组比较均明显降低(全部P值<0.05);在模型4、5和6,SI组MMP水平与C组比较均明显升高(全部P值<0.05)。在模型1、2、3、4、5、6和7,SIR-0.5h组MMP水平与相应的SI组比较差异均无显著统计学意义(全部P值>0.05);在模型8、9、10、11和12,SIR-0.5h组MMP水平与相应的SI组比较均明显升高(全部P值<0.05)。第三部分:采用心肌细胞-内皮细胞-巨噬细胞共培养系统探索构建再灌注损伤离体细胞模型的方法本部分实验是采用transwell小室构建心肌细胞-内皮细胞-巨噬细胞共培养系统,采用12种离体建模方法,对该共培养系统实施SI处理和SIR处理,实验结束后检测心肌细胞的活细胞百分比,观察SIR处理是否能够导致该培养系统中的心肌细胞发生再灌注损伤。该部分实验旨在探索借助心肌细胞-内皮细胞-巨噬细胞共培养系统是否可成功构建再灌注损伤的离体细胞模型。根据实验目的,对于每种模型,共培养系统被随机分成:①C组,共培养系统中的细胞正常培养;②SI处理组,对共培养系统中的细胞实施SI处理;③SIR-0.5h处理组,对共培养系统中的细胞实施SI处理后再实施SR处理0.5 h。对于模型1～10,SI处理时间为6 h;对于模型11和12,SI处理时间为30 min。结果显示,采用transwell小室可成功构建心肌细胞-内皮细胞-巨噬细胞共培养系统。将心肌细胞培养于下室、内皮细胞和巨噬细胞培养于上室使三种细胞均获得了良好的生长。对心肌细胞-内皮细胞-巨噬细胞共培养系统实施SI处理可导致心肌细胞损伤,心肌细胞活细胞百分比明显减少(与C组相比,全部P值<0.05)。随后对共培养系统实施SR处理,SIR-0.5h组心肌细胞活细胞百分比与SI组相比无明显降低。结论根据对上述三部分实验结果的综合分析,我们可得出以下结论。1.在实验的12种模型,SI处理均可导致乳大鼠和H9c2心肌细胞损伤,表现为形态学明显改变、LDH释放率明显升高和ATP水平明显降低;但是,对遭受SI处理的心肌细胞实施SR处理并未导致进一步的损伤,即心肌细胞损伤形态学表现未进一步恶化和LDH释放率未进一步升高(甚至明显降低),而且ATP水平明显恢复。这些结果提示对乳大鼠和H9c2心肌细胞实施SIR处理不能模拟出在体心肌再灌注损伤的特征。2.在实验的12种模型,对乳大鼠和H9c2心肌细胞实施SIR处理不能导致在体心肌IRI的典型病理生理改变,例如ROS爆发性生成、Ca2+离子超载、过度炎症反应和mPTP开放等,提示这些模型不是研究在体心肌IRI发生机制及其相关干预的合适手段。3.对于实验的12种模型,即使采用心肌细胞-内皮细胞-巨噬细胞共培养系统,也仅能模拟在体心肌缺血性损伤,而不能成功模拟在体心肌再灌注损伤。