肺炎克雷伯菌是临床常见的条件致病菌，也是院内感染的重要致病菌，毒力强，致死率高。一直是临床微生物学家关注的重要病原菌。近年来，其耐药性快速增加，常有该菌引起医院内感染暴发的报道。由于其多重耐药性，给治疗带来很大困难，除了主要对β-内酰胺类耐药以外，对喹诺酮类抗菌药也严重耐药。喹诺酮类抗菌药物(QNs)是近20年来发展十分迅速的一类抗菌药物，现在已经发展到第四代，因其抗菌谱广、抗菌活性强、使用方便、剂型较多等优点，在国内外临床控制感染性疾病中已普遍应用，其用量仅次于头胞菌素类和青霉素类。有报道显示有90％的医生把氟喹诺酮作为泌尿道感染的首选药，因而造成了耐药性的产生。细菌获喹诺酮类药物耐药的机制主要有三方面：1.药物作用靶位的结构基因突变致脱氧核糖核酸旋转酶(DNA促旋酶)和拓扑异构酶Ⅳ突变。2.细菌细胞膜通透性改变。3.控制细菌主动外排系统的调控基因突变而致主动外排增强。近年JohnH等[12]发现了可编码喹诺酮耐药的多重耐药质粒基因qnr(qnrA，qnrB,qnrS)，以qnrA研究最多，实验研究它可以保护DNA促旋酶DNAgyrase不受环丙沙星抑制。此基因可随质粒转移而传递，导致细菌的耐药性转移，引起临床医生高度重视。 国内目前对肺炎克雷伯菌的ESBLs、AmpC等产酶问题研究较多，而对其耐氟喹诺酮类药物研究较少。本研究对肺炎克雷伯菌多重耐药分布进行了分析，为临床治疗提供依据；对耐喹诺酮抗菌药株的靶酶进行研究，以期发现新的突变位点；筛查质粒，对发现质粒介导的耐药株进一步研究其耐药机理。 1.克雷伯菌属多重耐药现状分析 收集中山大学附一院临床细菌检验室2004年1月1日至12月31日分离培养的克雷伯菌223株，均经过VITEK-ASI60型全自动细菌鉴定、药敏分析系统bioMérieux(生物梅里埃)公司产品)鉴定(具体操作按其说明书)。药敏纸片方法测菌株耐药性，NCCLS推荐的表型筛选试验和表型确认试验检测ESBLs。在CIP耐药菌株中随机抽取60株进一步用浓度梯度法(E-test法)做MIC，药敏参照2004年美国临床实验室标准化委员(NCCLS)标准。 223株克雷伯菌中产酸克雷伯有4株，初筛产ESBLs103株(46.19％)，确证实验产ESBLs85株(38.12％)。60株耐CIP菌株中产ESBL42株(70％)。菌株来源以院内感染为主，ICU及内外科重症病人多见，夏天易感。药敏除了美洛培南、伊米配能、头孢西丁、头孢泊姆、丁胺卡那霉素较敏感以外，对大多数临床常用的抗菌素均表现较高的耐药性，而且多表现为多重耐药，对2种以上抗菌素同时耐药菌株达53.81％，对6种均敏感的只占29.15％，有3株对伊米配能也耐药。显示广州地区克雷伯菌耐药情况严峻。肺炎克雷伯菌产ESBL株已达38.12％，其中CIP耐药株产ESBL达到70％。可见肺炎克雷伯菌主要是对β-内酰胺类抗生素和氟喹诺酮类耐药，碳青霉烯类耐药性最低，头孢第4代、哌拉西林/他唑巴坦和丁胺卡那霉素等仍有较好的活性。为减少ESBL和多重耐菌株的产生，应注意谨慎合理的使用第三代头孢菌素及其他广谱抗菌药物。 2.质粒介导的克雷伯杆菌耐氟喹诺酮类药物机理研究 本实验临床分离株为2001年4月至2001年9月间，广东省(广州、深圳、中山)、湖南省(长沙、衡阳)及中山大学附属第三医院临床分离株，及于2004年1月至12月在中山大学附一院收集的克雷伯菌株共200株。通过煮沸法制备模板，PCR方法筛查qnrA。并进行质粒结合试验。检测ESBLs。qnrA阳性菌株进行靶酶(GyrA、GyrB、ParC、ParE)基因测定。PCR产物送基因公司测序。探针杂交技术对qnrA进行质粒定位。 结果筛查到携带qnrA的菌株2株，一株为肺炎克雷伯，另一株为产酸克雷伯，两株同时产ESBL均阳性。它们均对环丙沙星(CIP)中度敏感。进一步的确证实验和测序都证实含qnrA基因。 两株菌质粒结合实验后在选择平板上都有菌生长，而且其对环丙沙星MIC均有30倍以上的的提高，但定位实验尚未完成.本实验中亦发现有靶酶的改变，与前辈们的研究结果一致。 本研究中qnrA的检出率：kox1/6(16.67％)，Kpn1/194(0.5％)。和欧美等其它地方有差异，但表明在中国南方，也出现了质粒介导的喹诺酮耐药。qnrA的存在对临床细菌的喹诺酮耐药性有重要意义，也提示质粒介导的qnrA基因存在着跨种属广泛传递、导致耐药性播散的可能，临床医学工作者应予以高度重视，并采取积极措施进行预防和控制。 3.产气肠杆菌耐药研究 产气肠杆菌和肺炎克雷伯菌均是肠杆菌属细菌中一种比较常见的革兰氏阴性菌，也是医院内特别是重症监护病房导致严重感染的条件致病菌，亦有报道认为产气肠杆菌已经成为仅次于金黄色葡萄球菌和铜绿假单孢菌之后革兰氏阴性杆菌所至院内呼吸道感染的第三大菌。因为其耐药性的严重造成的治疗困难已经引起临床医生的高度重视，欧洲特别法国对此菌研究教多。本研究在细菌筛查过程中发现一株多重耐药的产气肠杆菌携带qnrA基因，对其做了进一步研究。 用浓度梯度法(E-test法)做MIC；检测ESBLs；质粒结合试验；PCR扩增qnrA。 结果菌株对临床常见的多种抗菌药物耐药，产ESBL阳性。携带qnrA基因，基因序列已经提交Genebank收录。并且结果证实此基因可以在菌株间转移，而且可以引起MIC几十倍的增长qnrA基因只介导低水平喹诺酮耐药，虽然它可以扩大靶酶GyrAPartC突变和膜通透性改变、外排泵导致的耐药性，是一个不容忽视的问题，应该引起临床医生足够重视。 小结 1.广州地区克雷伯菌耐药严重，大多表现为多重耐药，同时对2种及以上抗菌药物耐药率达53.81％。肺炎克雷伯菌产ESBL株达38.12％。选取的CIP耐药株产ESBLs株为70％。 2.本研究中qnrA的检出率：kox1/6(16.67％)，Kpn1/194(0.5％)。表明在中国南方，也存在质粒介导的喹诺酮耐药。质粒结合实验证实qnrA的移动对临床细菌的喹诺酮耐药有重要意义，也提示质粒介导的qnrA基因存在着跨种属广泛传递、导致耐药性播散的可能。国内尚未见此类报道。 3.本研究在细菌筛查过程中发现1株多重耐药的产气肠杆菌，产ESBLs，携带qnrA基因，并且此基因可以在菌株间转移。此基因序列已经提交Genebank收录。