水稻株型与粒型对提高产量至关重要,一直为育种家所关注。甾醇类激素油菜素内酯(Brassinosteroid,BR)在调控水稻株型与粒型方面起着重要作用。研究表明,BR参与植物多个生长和发育过程的调控,如促进细胞的分裂与伸长、参与维管组织的发育、参与对光的响应、提高抗逆抗病反应等。目前BR相关突变体与转基因植株的研究表明,BR在提高水稻产量方面具有巨大的应用潜力。尽管人们已经鉴定和研究了很多BR合成与信号转导途径调控因子,但是对BR的合成与信号通路调控机制的了解还是有限的。为此,在水稻中,对BR合成与信号转导途径及其调控机制开展相关研究是十分必要的。本学位论文主要围绕两个BR相关突变体开展研究,第一部分为水稻BR不敏感基因DS1的图位克隆和功能分析,第二部分为水稻BR合成基因LHDD10的图位克隆和功能分析。第一部分:在本研究中,我们从南粳35辐射诱变突变库中分离和鉴定了一个表现出株高矮化、籽粒变小和叶片直立表型的突变体dwarf and small grain 1(ds1)。通过基因定位及功能分析,阐明了ds1表型的遗传机理与内在的分子调控机制。从细胞学水平和生理生化等方面对ds1进行了较为详细的研究。不仅使人们对水稻株型调控机理的认识加深,也为育种家培育出“理想株型”的水稻高产品种提供了重要的理论支持。主要研究结果如下:1.相比野生型,突变体ds1植株矮化、籽粒变小和叶片直立,这些表型类似于BR合成与信号缺陷突变体的表型,比如brd1与d61。外源BR敏感性测试表明,ds1突变体对外源BR处理的敏感性降低,表明突变基因可能影响BR信号途径。茎秆与颖壳的扫描电镜观察,表明突变体细胞变小导致了ds1的突变表型,且细胞扩张与细胞壁合成相关的基因在突变体中显著下调。将突变体ds1与野生型进行杂交和遗传分析,结果表明ds1的突变表型为单一隐性核基因控制。2.以ds1突变体为母本,滇粳优为父本进行杂交,构建F2遗传分离群体,用于突变基因的定位,最终将ds1定位在第1染色体长臂上80 kb的区域内。结合水稻基因数据库与基因组测序发现,定位区间的基因LOC_Os01g12890的第一与第二外显子和野生型相比存在3个碱基的缺失,导致蛋白功能丧失。通过转基因互补实验,证实ds1的突变表型是 LOC_Os01g12890的突变导致的,即LOC_Os01g12890为DS1。DS1基因组全长为4655 bp,包含4个外显子和3个内含子,编码区全长为3174 bp,编码一个含有1057个氨基酸的蛋白,为一个类EMBRYONIC FLOWER(EMF1)的蛋白,与拟南芥蛋白AtEMF1氨基酸具有37%的相似性,同源性为20%。结构域分析发现在DS1蛋白N端存在一个核定位信号(NLS)与GTP-ATP绑定的基序,而在C末端含有一个介导蛋白相互作用的LXXLL结构域。3.通过qRT-PCR分析,发现在突变体中多数BR信号相关基因的表达显著下调,其中OsBRI1的表达下调程度最高。由此,DS1的突变导致BR信号基因表达发生变化,最终影响水稻植株的生长发育。组织表达分析表明DS1在幼叶、穗与种子中强烈表达,在茎尖、茎与根中表达较低。有趣的是,突变体中ds1表达模式与野生型一致,且DS1的表达量无差异;在外源BL处理后DS1的表达量显著上调,这一结果表明BR可以诱导DS1的表达。4.通过酵母双交系统,发现DS1可与生长素响应因子OsARF11互作,且DS1的C端与OsARF11的中间结构域是两者互作所必需的。通过体内BiFC和体外pull-down实验进一步证实了 DS1与OsARF11存在互作。通过Crispr/Cas9敲除OsARF11,发现敲除的阳性植株均表现出矮化与叶片直立的表型,这些突变表型与ds1突变体的表型十分相似。在突变体osarf11中,OsBRI1的表达也显著下调。综合以上结果说明DS1通过与OsARF11互作,来调控水稻的生长发育。5.前人研究表明,水稻OsARFs可直接结合OsBRI1启动子上的AuxRE(TGTCTC)基序调控其表达。通过酵母单杂与瞬时表达实验,证明DS1与OsARF11互作,激活OsBRI1的转录。第二部分:本研究中,突变体late heading date and dwarf(lhdd10)是从籼稻品种93-11的EMS诱变后代中筛选到一个BR合成缺陷型突变体,表现为株高变矮、籽粒变小、抽穗期延迟。通过图位克隆和功能分析,揭示了LHDD10调控植株高度、粒型及抽穗期的遗传与调控机理,为将来通过基因组编辑等技术创造与培育优良的水稻高产品种提供重要的理论支持。主要研究结果如下:1.Lhdd10较93-11籽粒粒长变短,粒重减小、矮化、抽穗期延迟、叶色深绿。通过茎秆细胞的纵向石蜡切片观察,发现相比野生型,Lhdd10节间细胞明显变小,这可能是突变体lhdd10籽粒变小与矮化的主要原因。将突变体Lhdd10与野生型杂交,进行遗传分析,结果表明lhdd10突变表型为单隐性核基因控制。2.外源BR处理的结果表明Lhdd10是BR合成存在缺陷的突变体。qRT-PCR结果提示在突变体中多数BR合成与信号转导相关基因的表达下调。因此,LHDD10基因的突变引起BR合成与信号转导相关基因转录水平发生显著变化,进而影响水稻的正常生长。3.将lhdd10与KetanNanga杂交,构建F2遗传分离群体,将lhdd10定位在第10染色体长臂130 kb的区间内。利用水稻基因数据库,发现在130 kb的区间内含有11个ORFs(Open Reading Frames)。基因组测序发现LOC_Os10g25780的编码区存在一个单碱基的替换。QRT-PCR结果显示LHDD10在幼穗和茎尖中强烈表达,其次在叶枕、幼根、叶片中表达。生物信息学方法分析表明LHDD10编码一个假定的FAD氧化还原酶。4.lhdd10突变体在长日照、短日照下均表现为抽穗延迟。对长、短日照处理抽穗期相关基因的表达分析,发现抽穗期相关基因DTH8、OsDMAS51、OsGI和Ghd7在野生型和突变体间无差异,而Ehd1、OsMADS50和RFT1均显著下调。5.lhdd10突变体籽粒变小,粒长与粒宽都降低,而粒厚无显著差异。对已知的粒型调控因子的表达分析发现GL3.2、GL7、PGL2、GW5、GS3、SG1与OsSPL13在突变体中表达显著下调,这暗示LHDD10可能通过影响粒型基因的表达,参与对水稻粒型的调控。