对于大多数蛋白质来说,多肽链翻译后还要进行多种加工修饰才具备生物学活性。蛋白质翻译后修饰的主要方式有：磷酸化、糖基化、脂质化等等。棕榈酰化作为脂质化修饰方式的一种,其功能是由DHHC蛋白质执行的。DHHC蛋白最早是在酿酒酵母中发现的,正向遗传筛选结果表明Erf2/Erf4和Akrl是酵母中的DHHC蛋白,都富含特征性锌指样(Zinc finger)-DHHC (Aspartate-histidine-histidine-cysteine)结构域,负责RAS2和酵母酪蛋白激酶2的修饰。除了在酵母已确定的7种DHHC蛋白,哺乳动物已发现23种DHHC家族成员,这些DHHC蛋白又被细分为不同的亚家族。2004年,Bredt DS研究小组完成了人类及小鼠基因组23种DHHC基因的克隆与鉴定,与此同时,蛋白质组学和影像学技术的进步,加速了人们对这类蛋白功能的认识。家族遗传分析结果表明DHHC蛋白质在神经系统发育和相关神经疾病的病发过程中起到重要的调控作用。研究发现,对于精神分裂症和其它精神障碍来说DHHC8是一个高风险因素；ZDHHC12参与淀粉样前体蛋白(APP)的运输和代谢调节,提示ZDHHC12可能参与阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease, AD)的发生；DHHC17被鉴定为亨廷顿相互作用蛋白；染色体X和ZDHHC15基因之间的平衡相互易位导致ZDHHC15转录产物缺失,造成X连锁精神发育迟滞(X-linked mental retardation, XLMR);另据报道ZDHHC9突变与XLMR相关。随着对DHHC蛋白底物研究的日益深入,人们发现多种神经蛋白可被DHHC蛋白修饰,从而在神经发育中发挥重要作用,如突触的形成和生长、神经递质的释放、离子通路的调节、调控细胞生长、命运决定等。研究表明DHHC3参与突触功能作用；而DHHC5参与体外培养的神经元分化过程。上述研究提示DHHC蛋白家族成员在神经系统正常结构的建立以及功能的完善过程中发挥着举足轻重的作用,但具体的作用机制还不清楚。因此阐明DHHC蛋白在神经系统中的作用及分子调控机制成为近年来神经科学领域的研究重点。此外,随着生活节奏的加快,抑郁症的发病率逐年上升。虽然人类在抑郁症的研究方面付出了大量的努力,但对其发病机制仍知之甚少。同时,抗抑郁药发挥其治疗作用的分子和细胞机制尚未给出很好的解释。早期关于抑郁症的病理生理学假说是基于主要的神经递质5-羟色氨(5-hydroxy tryptamine,5-HT)和去甲肾上腺素(Norepinephrine, NE)的释放减少。因此,5-羟色氨和去甲肾上腺素成为目前抑郁症治疗的措施和药物开发的主要目标。但随着神经生物学的发展,简单的神经递质学说无法解释抑郁症的发病机制。最近,神经元的神经生成作用的降低为抑郁症提供了崭新的生物学和细胞学研究基础。有研究表明抗抑郁药可能会促进神经元再生增加细胞数目从而达到治疗抑郁症的目的,但具体的作用机制还尚未明确。随着斑马鱼基因组测序工程的完成,人们发现斑马鱼的基因与人类的基因保守程度达到85%；此外,斑马鱼胚胎透明,可以在镜下准确观察其组织器官的发育过程以及基因在生物体内的表达模式,使得斑马鱼成为研究人类疾病的理想模式动物。同时,斑马鱼胚胎发育遗传学技术的逐步建立和完善也为斑马鱼的人类疾病模型的建立和分析提供了良好的基础。本实验用斑马鱼作为模式动物,同时探讨了DHHC家族成员Zdhhcl5b以及抗抑郁药物bupropion在斑马鱼神经系统发育中的作用及机制。第一章Zdhhcl5b基因调节斑马鱼胚胎间脑多巴胺能神经元分化的研究背景介绍DHHC 15 (zinc finger DHHC-type containing 15)是哺乳动物23种DHHC蛋白中的第15号成员。该基因是由332个氨基酸组成的跨膜蛋白,具有四个跨膜结构域和一个DHHC (Aspartate-histidine-histidine-cysteine)-CRD (Cysteine rich domain)特征结构域。与其他成员相比,目前对DHHC 15的研究报道还比较少,且停留于体外水平。据报道,DHHC 15与X连锁精神发育迟滞相关,且DHHC 15可以修饰相应的神经蛋白,这提示DHHC15在神经系统发育中起到重要作用。但是,DHHC15在神经系统发育过程中的功能和机制尚不明确。分析斑马鱼DHHC基因发现Zdhhcl5b与哺乳动物DHHC 15同源且两者编码的氨基酸序列高度保守。因此,本研究利用斑马鱼作为模式动物,通过注射norpholino建立人类DHHC 15的同源基因Zdhhcl5b的下调模型,利用斑马鱼胚胎整封原位杂交(Whole-mount in situ hybridization, WISH)、整封免疫荧光、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)、免疫组化、行为学检测等方法研究Zdhhcl5b对斑马鱼神经系统发育的影响,并深入探讨了其在斑马鱼间脑多巴胺能神经元(dopaminergic neurons, DA neuron)分化中的作用及其机制。研究内容首先,为了了解Zdhhcl5b在斑马鱼早期胚胎发育中的表达模式,本课题设计了Zdhhcl5b的特异性引物及地高辛标记的反义RNA探针,利用RT-PCR和原位杂交(whole-mount in situ hybridization, WISH)技术检测Zdhhcl5b在斑马鱼胚胎发育各时期的表达以及分布情况。原位杂交结果显示,Zdhhcl5b是母源性表达,并且从18hpf到48hpf, Zdhhcl5b大量存在于脑区,尤其是间脑。RT-PCR实验结果显示Zdhhcl5b的表达从75%外包期开始增加,18hpf到72hpf逐渐达到峰值。提示Zdhhcl5b可能在斑马鱼间脑发育中的特定阶段发挥重要作用。为了确定Zdhhcl5b是否作用于斑马鱼间脑发育,本实验利用反向遗传学手段,设计合成Zdhhcl5b morpholino (MO),在斑马鱼胚胎发育1cell时期进行显微注射建立Zdhhcl5b下调模型。结果发现,与对照组相比,Zdhhcl5b抑制后斑马鱼发育至24hpf时出现间脑发育缺陷。进一步的研究发现Zdhhcl5b基因下调表达导致斑马鱼学习认知障碍。提示Zdhhcl5b参与斑马鱼间脑发育并在此过程中发挥重要作用。多巴胺能神经元(dopaminergic neuron, DA neuron),作为脊椎动物间脑的重要组成部分,在认知、运动控制和内分泌调节中起关键作用。Zdhhcl5b下调表达引起的间脑发育缺陷和学习认知障碍促使本课题进一步研究Zdhhcl5b在多巴胺能神经元发育中的潜在作用。酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase, TH)和多巴胺转运蛋白(dopamine transporter, DAT)是多巴胺能神经元的特异性标记物。首先,TH免疫荧光发现TH与Zdhhc15b表达区域重叠,这是Zdhhc15b可能会参与多巴胺能神经元的发育的直接证据。其次,RT-PCR结果显示Zdhhc15b基因下调后TH/DAT表达量在24hpf明显降低,而胶质细胞和运动神经48hpf元标记物的表达没有明显变化,这一结果提示特异性地作用于多巴胺Zdhhc15b能神经元发育。为了验证这一推论,本研究采用TH和DAT原位杂交、TH整封免疫荧光、TH蛋白质印迹(WB)等技术检测TH和在DAT和蛋白水平mRNA的表达变化。结果显示,基因下调后斑马鱼腹侧间脑Zdhhc15b标记的TH/DAT阳性多巴胺能神经元较少,且TH蛋白质表达量降低。以上结果提示特异性地参与了斑马鱼腹侧间脑多巴胺能神经元的发育过程。Zdhhc15b多巴胺能神经元前体细胞捕获分化信号获得分化特征,最终成长为成熟的多巴胺能神经元。为了研究影响多巴胺能神经元发育的具体阶段,首先Zdhhc15b进行了原位杂交和BrdU掺入实验。结果分析表明,PCNA下调前后Zdhhc15b多巴胺能神经元前体细胞的增殖周期与对照相比无明显变化。因此推断,对多巴胺能神经元前体细胞的增殖没有影响；多巴胺能神经元前体细Zdhhc15b胞增殖的结果就是多巴胺前体神经元的增加,ngnl是多巴胺能神经元的标记物。为了进一步检测对多巴胺能神经元前体细胞特性获得的影响,开展了Z dhhc15b原位杂交实验。结果显示,ngn1在ngn1下调前后等量表达,这表明多Zdhhc15b巴胺能神经元前体细胞的特性获得与的作用无关；接下来为了检测Zdhhc15b对多巴胺能神经元存活的影响,本实验用吖啶橙染色法检测巴胺能神Zdhhc15b经元的凋亡情况。染色结果表明,细胞凋亡在下Zdhhc15b调前后没有明显变化,提示不影响多巴胺能神经元的凋亡；接下来为了确定多巴胺能神经元Zdhhc15b分化过程是否需要调节,本课题进行了多巴胺能神经元分化相关基因Zdhhc15b的原位杂交实验和其他相关因子的nurr1筛选实验。RT-PCR是多巴胺能神Nurr1经元分化的标记物,原位杂交结果显示,在基因下调后其表达量明显Zdhhc15b降低。同时,结果显示,参与多巴胺能神经元分化的作用因子RT-PCR在lmx1a、 foxA、pitx3下调后表达量降低；与此相反,en1/2和ebf2的表达量Zdhhc15b在下调前后没有显著变化。提示Zdhhc15b特异性调节多巴胺能神经Zdhhc15b元分化过程。进一步用技术筛选与多巴胺能神经元发育分化相关信号通RT-PCR路发现,和Shh (SonicHedgehog)信号通路交互作用于W nt/β-cateninZdhhc15b调节的多巴胺能神经元分化过程。提示Zdhhcl5b可能通过Shh(SonicHedgehog)和Wnt/β-catenin信号通路召募相关的作用因子特异性调节多巴胺能神经元分化。结论本课题使用斑马鱼作为模式生物,首次研究了Zdhhcl5b在斑马鱼体内的时空表达模式。结果显示,Zdhhcl5b在斑马鱼间脑高表达,并呈现阶段特异性。注射吗啉代寡核苷酸建立Zdhhcl5b下调模型,发现Zdhhcl5b下调导致斑马鱼腹侧间脑区域成熟的多巴胺能神经元减少,从而导致间脑发育缺陷以及相应的学习认知障碍。进一步的研究发现,下调斑马鱼Zdhhcl5b表达影响斑马鱼腹侧间脑多巴胺能神经元的分化。Zdhhcl5b下调后foxA2, lmx1a和pitx3表达量降低。由此得出结论,Zdhhcl5b可能通过Shh和Wnt/β-catenin信号通路召募一系列的多巴胺能神经元分化相关转录因子影响多巴胺能神经元分化。也就是说通过调节多巴胺能神经元的分化,Zdhhcl5b充当决定性因素,调节多巴胺能神经元前体细胞向成熟多巴胺能神经元命运的转化。本研究加深了对DHHC蛋白家族在神经发育中功能的理解,同时为多巴胺能神经元的发育的研究,特别是为多巴胺能神经元功能障碍引起的疾病(如阿尔茨海默和帕金森氏病等神经系统疾病)的研究和临床治疗提供了新的线索。第二章bupropion于斑马鱼腹侧间脑多巴胺能神经元的增殖和保护作用背景介绍抑郁症是一种常见的具有高发病率、高复发率和高致残率等特点的精神疾病。抑郁症发病率近年来有逐渐增高的趋势,在普通人群中的发病率男性为5%-12%,女性为10%～25%。抑郁症已经成为威胁人们心身健康的一大隐患。Bupropion是一种氨基酮类新型抗抑郁药物。随着对bupropion的深入研究也陆续发现了其在戒烟、改善酒精依赖、注意缺陷多动障碍(attention deficit hyperactive disorder, ADHD)等疾病方面的治疗作用。尽管有这些重要进展,其作用机制尚未完全了解。此外,有研究表明抗抑郁药可能会通过促进神经元再生增加神经元数目达到治疗抑郁症的目的。众所周知,多巴胺能神经元与抑郁症的发生密切相关,那么bupropion对多巴胺能神经元有什么作用,其机制是什么是本课题研究的科学问题。本研究用斑马鱼作为模式生物,建立多巴胺能神经元的MPTP (1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPTP)损伤模型,分别从体内、体外两个方面通过胚胎整封原位杂交(Whole-mount in situ hybridization, WISH)、整封免疫荧光、细胞免疫组化、行为学检测等方法研究了bupropion对斑马鱼多巴胺能神经元的作用,并深入探讨了其机制。研究内容为了检测bupropion对多巴胺能神经元是否有作用,本课题首先建立了多巴胺能神经元的MPTP (1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPT P)损伤模型。实验分为对照组、MPTP (5ug/mL)、bupropion (100、300μM)+MPTP组。TH/DAT原位杂交/TH免疫荧光结果显示,在斑马鱼腹侧间脑区域出现TH标记的多巴胺能神经元,MPTP (5μg/mL)处理组的多巴胺能神经元与对照比相比明显减少；而bupropion可以改善MPTP对多巴胺能神经元的损伤,bupropion处理后斑马鱼胚胎腹侧间脑多巴胺能神经元比损伤组明显增多并呈浓度依赖型。为了进一步确认bupropion对多巴胺能神经元的作用,取斑马鱼间脑进行了多巴胺能神经元的体外培养。实验分为对照组、MPP+(10μM)、bupropion+MPP+C 75μM),TH免疫荧光检测多巴胺能神经元阳性细胞数目。结果显示bupropion可以改善MPP+对多巴胺能神经元的损伤,bupropion处理组TH阳性多巴胺能神经元数目比MPP+组明显增多,结果与体内实验一致。为了进一步检钡bupropion对多巴胺能神经元功能的影响本课题进行了T迷宫实验,结果表明bupropion可以改善MPTP引起的斑马鱼认知功能障碍。以上结果提示bupropion对斑马鱼间脑多巴胺能神经元发育过程起到重要作用。鉴于bupropion处理后TH+/DAT+神经元的数目的增加,这促使本文检测定bupropion对多巴胺能神经元是否有保护作用。为此,在斑马鱼胚胎发育24hpf和48hpf时期进行吖啶橙染色实验。结果显示,与对照组相比,MPTP损伤组的多巴胺能神经元凋亡数目增多,而bupropion处理组的多巴胺能神经元的凋亡数目比MPTP损伤组明显减少。提示bupropion对多巴胺能神经元具有保护作用。研究发现抗抑郁药物对抑郁症的治疗都需要比较长的疗程,有人提出抗抑郁药物可能通过促进神经元增殖达到神经元数目增加的效果,从而达到治疗的目的。为了检测bupropion对多巴胺能神经元的神经生成作用,首先开展了PCNA原位杂交和BrdU掺入实验,结果表明斑bupropion处理组多巴胺能神经元存在的PT(posteriortuberculum, PT)区域处于增殖状态的神经元明显多于MPTP损伤组。提示bupropion对多巴胺能神经元前体细胞增殖有重要作用。Ngn1是多巴胺能神经元前体细胞的特异性标记物,ngnl原位杂交结果显示,bupropion处理组的ngnl表达量比MPTP损伤组明显增强。为了进一步证明bupropion的神经生成作用,当斑马鱼发育至16-18hp耐取多巴胺前体神经元进行体外培养,ngnl免疫荧光结果显示bupropion处理组与MPP+组相比,处于增殖状态的多巴胺前体神经元数目明显增多,与体内实验结果一致。以上结果提示,bupropion在多巴胺前体神经元增殖过程中发挥重要作用。与多巴胺能神经元再生和前期诱导相关的转录因子筛选发现,bupropion处理组的enl、en2的表达量比MPTP组明显升高,推测bupropion可能通过相关转录因子调节多巴胺能神经元的增殖再生,但具体机制还有待进一步研究。结论抑郁症发病机制及抗抑郁药物主要治疗机制目前还不清楚,而且由于缺乏人类临床研究,这是目前面临的一个重大科学问题。本研究发现bupropion具有保护和促进多巴胺能神经元再生的作用,这将深化人们对bupropion作为抗抑郁药物的治疗机制的认识。同时,bupropion对多巴胺能神经元的再生可能为抑郁症或相关精神疾病的治疗提供新的靶标。此外,对参与多巴胺能神经元发育的细胞及分子机制的全面了解,将大大推动对抑郁症的治疗和多巴胺能神经元功能障碍引起的其他精神疾病的药物治疗。