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骨关节炎(Osteoarthritis, OA)是一种在老年人中较为常见的关节退行性病变，其影像学下主要特征是关节软骨破坏、关节间隙变窄伴骨赘形成，其临床症状主要表现为关节疼痛肿胀伴活动受限，严重者可出现关节畸形等，对老年人的日常活动以及生活质量造成了严重不良影响。目前研究普遍认为，年龄，性别，遗传，肥胖和基因等因素与骨关节炎的发生发展有着密切的关系。但不幸的是，OA的确切病理生理及发病机制仍不十分清楚，这导致了目前缺乏有效的OA治疗方法。
大量的研究显示，炎症反应(Inflammation)在骨关节炎的病理发展进程中起重要作用，作为公认的两条经典的调控炎症信号的通路，抑制NF-κB信号通路和MAPK信号通路的过度激活被认为可以有效地减少软骨炎症和软骨退变，并可延缓OA发展。因此，深入研究骨关节炎的病理机制，寻找可以调控软骨细胞中NF-κB信号通路和MAPK信号通路的药物或者基因，或许可以为OA的治疗提供新的方法。
研究表明，双特异性磷酸酶5(DUSP5)具有特异性地作用于细胞核中ERK1/2通路并使其去磷酸化(失活)的功能，相关研究表明，DUSP5参与了许多疾病的发生发展，包括肺纤维化、自身免疫性关节炎、心血管疾病和癌症等，且具有一定抗炎和保护性作用。但是，目前DUSP5在OA软骨细胞中的作用和功能尚未明确。
因此，此项研究的目的是探究DUSP5在骨关节炎中的抗炎作用及其抗炎机制。首先，研究了DUSP5在OA病人和正常人软骨组织上的表达差异，然后通过运用小干扰RNA(siRNA)和慢病毒等工具，在体内、体外构建敲低或者过表达DUSP5的模型，通过使用western-blot、QRT-PCR、番红-固绿染色及免疫荧光等技术，研究骨关节炎中特征性的炎症指标及相关炎症信号通路指标，进一步完善了骨关节炎的发病机制，并阐明了DUSP5在骨关节炎中的抗炎作用及其机制，试图为骨关节炎的治疗提供新的思路。
本研究将分为以下3个部分：
1．DUSP5在OA病人软骨组织及体外大鼠软骨细胞诱导炎症后的表达情况；
2．DUSP5在大鼠体外、体内骨关节炎模型中对炎症的调控作用；
3．DUSP5在骨关节炎中的抗炎作用机制研究。
第一章DUSP5在OA病人软骨组织及体外大鼠软骨细胞诱导炎症后的表达情况
研究目的：
研究DUSP5在OA病人和正常人间的表达差异及体外大鼠软骨细胞诱导炎症后的表达情况。
研究方法：
在浙江大学医学院附属第二医院滨江院区关节外科，收集了髋OA病人及股骨颈骨折病人全髋关节置换手术过程中废弃的髋关节软骨组织各6例。通过番红-固绿染色研究OA病人和正常人软骨组织蜕变情况，然后通过组织免疫荧光、western-blot技术研究人体软骨组织中DUSP5的表达情况。此外，应用10ng/mL的IL-1β刺激离体培养的大鼠软骨细胞构建骨关节炎细胞模型，探究DUSP5表达情况与IL-1β作用时间及浓度的关系。
结果：
番红-固绿染色结果表明OA病人的软骨组织磨损、退变情况比正常人显著，组织免疫荧光结果及western-blot结果均显示，与正常人软骨组织相比，在OA病人髋关节软骨组织中，DUSP5处于显著低表达的水平(P＜0.05)。体外OA模型中，随着IL-1β浓度的提高，DUSP5的表达水平也逐渐升高，在10ng/mL的IL-1β刺激下，随着作用时间的延长，DUSP5的表达也随之升高。
结论：
DUSP5在人OA软骨组织中呈显著低表达，而短时间内，在离体培养的大鼠软骨细胞骨关节炎模型中，DUSP5的表达随IL-1β浓度的升高而升高，随IL-1β作用时间的延长呈现出正相关。我们猜测，短时间内炎症刺激如IL-1β会诱发DUSP5的表达，但骨关节炎是一个长期慢性进展的疾病，长期炎症刺激可能会抑制DUSP5的表达，同时有研究发现，DUSP5蛋白是短时程蛋白(short-lived protein)，在细胞核内无法长期稳定存在，易被泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system, UPS)降解，这或许可以解释人OA软骨组织中为什么DUSP5呈低表达，但需要做进一步的研究。
第二章DUSP5在大鼠体外、体内骨关节炎模型中对炎症的调控作用
研究目的：
探究DUSP5在大鼠体外及体内骨关节炎模型中对软骨炎症反应的调控作用。
研究方法：
在离体培养的大鼠软骨细胞中，分别应用小干扰RNA(Small interfering RNA, siRNA)和DUSP5基因过表达慢病毒载体技术，构建DUSP5敲低或者过表达的大鼠软骨细胞，应用QRT-PCR、western-blot等检测技术，通过检测骨关节炎特征性的炎症指标MMP3、MMP9、MMP13、COX2、iNOS等的mRNA及蛋白表达情况，分别研究了DUSP5低表达和高表达对IL-1β介导的离体大鼠软骨细胞炎症反应的影响。在体内实验中，通过对大鼠膝关节实施内侧半月板切除术(destabilization of the medial meniscus, DMM)构建大鼠膝关节OA模型，从DMM手术完成后1周开始，通过往大鼠关节腔内注射慢病毒的方式，构建DUSP5敲低或者过表达模型(每2周注射1次，共注射2次)。50只大鼠随机分成5组，每组10只：Sham组设置为空白对照组，进行DMM假手术，术后往大鼠关节腔内注射无菌PBS；Len-OE为过表达组，术后往大鼠关节腔内注射等量DUSP5过表达慢病毒；Len-NC作为过表达实验的对照组，术后往大鼠关节腔内注射等量的过表达对照慢病毒；Sh-KD为敲除组，术后往大鼠关节腔内注射等量DUSP5敲除慢病毒；Sh-NC为敲除实验的对照组，术后往大鼠关节腔内注射等量的敲除对照慢病毒。造模后5周处死大鼠，取膝关节软骨组织进行QRT-PCR，检测DUSP5的表达情况，验证敲除和过表达效率。取大鼠膝关节固定、脱钙后的切片进行番红-固绿染色、组织免疫荧光，检测软骨磨损、退变情况及炎症指标表达情况。
结果：
在体外实验中，敲低实验显示，使用siRNA可以有效降低大鼠软骨细胞DUSP5的mRNA及蛋白表达水平(P＜0.05)，QRT-PCR结果显示，敲低DUSP5后，IL-1β刺激24h可以显著提高大鼠软骨细胞内的炎症特异性基因iNOS、COX2、MMP9、MMP13和MMP3的mRNA表达(P＜0.05)，同样的，western-blot实验结果表明，敲低DUSP5后，IL-1β刺激24h显著地增强了大鼠软骨细胞内的炎症特异性基因iNOS、COX2、MMP13蛋白表达(P＜0.05)。
而过表达实验显示，使用过表达慢病毒可以有效提升大鼠软骨细胞DUSP5的mRNA及蛋白表达水平(P＜0.05)，QRT-PCR结果显示，过表达DUSP5可以有效抑制IL-1β诱导24h下的大鼠软骨细胞内的炎症特异性基因iNOS、COX2、MMP9、MMP13、MMP3的mRNA的表达(P＜0.05)，western-blot结果显示，过表达DUSP5可以显著地降低IL-1β刺激24h后的大鼠软骨细胞内的炎症特异性基因iNOS、COX2、MMP13、MMP9蛋白表达(P＜0.05)。
在大鼠的体内实验中，我们运用QRT-PCR技术对大鼠膝关节软骨组织中DUSP5表达水平进行测定，结果显示，运用敲除或者过表达慢病毒进行关节腔注射，可以有效敲低或者过表达DUSP5(P＜0.05)。此外，我们对大鼠的膝关节进行切片，然后对切片进行番红-固绿染色实验和组织免疫荧光实验，结果显示，过表达DUSP5后，大鼠膝关节软骨磨损情况及退变程度显著低于对照组，同时炎症蛋白COX2的表达水平也显著低于其对照组，而敲低DUSP5后，大鼠膝关节软骨磨损情况和退变程度均显著高于对照组，炎症蛋白COX2的表达水平也显著高于其对照组。体外实验和体内实验结果一致，均可以有效说明DUSP5在骨关节炎中具有一定抗炎作用。
结论：
DUSP5对大鼠软骨具有保护作用，在软骨炎症反应及骨关节炎病理过程中具有一定抗炎作用。
第三章DUSP5在骨关节炎中的抗炎作用机制研究
研究目的：
探究DUSP5在骨关节炎中的抗炎作用机制。
研究方法：
在离体培养的大鼠软骨细胞中，分别应用小干扰RNA(Small interfering RNA, siRNA)和DUSP5基因过表达慢病毒载体技术，构建DUSP5敲低或者过表达的大鼠软骨细胞，依据参考文献，使用IL-1β刺激10min构建该部分实验所需模型，应用western-blot技术检测NF-κB通路中的p65、p-p65蛋白表达情况及MAPK通路中的erk、p-erk蛋白表达情况，同时应用细胞荧光技术检测p65的入核情况，研究DUSP5在骨关节炎中的抗炎作用机制。此外，在DUSP5敲低实验中，进一步设计挽救实验，在IL-1β刺激大鼠软骨细胞之前，分别使用QNZ(NF-κB信号通路的特异性抑制剂)和GDC(ERK1/2信号通路特异性抑制剂)特异性阻断相应的信号通路，然后通过western-blot实验检测大鼠软骨细胞中炎症特异性蛋白iNOS、COX2和MMP9的表达水平。
结果：
使用siRNA敲低大鼠软骨细胞DUSP5表达水平后，IL-1β刺激10min后，western-blot结果显示p-p65、p-erk表达显著升高(P＜0.05)，细胞荧光显示p65入核比对照组显著增多，表明敲低DUSP5后，IL-1β可以诱导更高活性的NF-κB和ERK1/2通路的表达。IL-1β刺激10min条件下，western-blot结果显示DUSP5过表达的大鼠软骨细胞中p-p65、p-erk表达显著减少(P＜0.05)，细胞荧光显示p65入核比对照组显著减少，表明过表达DUSP5后，IL-1β诱导的NF-κB和ERK1/2通路的表达被有效抑制。在挽救实验中，IL-1β刺激大鼠软骨细胞之前，分别使用QNZ(NF-κB信号通路的特异性抑制剂)和GDC(ERK1/2信号通路特异性抑制剂)特异性阻断相应的信号通路后，western-blot结果显示，IL-1β刺激敲低DUSP5的软骨细胞所引起的iNOS、COX2、MMP9的高表达均可被有效抑制(P＜0.05)，这进一步说明，DUSP5在软骨细胞炎症反应中所起到的抗炎作用确实是通过抑制NF-κB和ERK1/2信号通路来实现的。
结论：
在大鼠软骨细胞炎症和骨关节炎中，DUSP5的抗炎作用是通过抑制NF-κB和ERK1/2信号通路实现的。
大量的研究显示，炎症反应(Inflammation)在骨关节炎的病理发展进程中起重要作用，作为公认的两条经典的调控炎症信号的通路，抑制NF-κB信号通路和MAPK信号通路的过度激活被认为可以有效地减少软骨炎症和软骨退变，并可延缓OA发展。因此，深入研究骨关节炎的病理机制，寻找可以调控软骨细胞中NF-κB信号通路和MAPK信号通路的药物或者基因，或许可以为OA的治疗提供新的方法。
研究表明，双特异性磷酸酶5(DUSP5)具有特异性地作用于细胞核中ERK1/2通路并使其去磷酸化(失活)的功能，相关研究表明，DUSP5参与了许多疾病的发生发展，包括肺纤维化、自身免疫性关节炎、心血管疾病和癌症等，且具有一定抗炎和保护性作用。但是，目前DUSP5在OA软骨细胞中的作用和功能尚未明确。
因此，此项研究的目的是探究DUSP5在骨关节炎中的抗炎作用及其抗炎机制。首先，研究了DUSP5在OA病人和正常人软骨组织上的表达差异，然后通过运用小干扰RNA(siRNA)和慢病毒等工具，在体内、体外构建敲低或者过表达DUSP5的模型，通过使用western-blot、QRT-PCR、番红-固绿染色及免疫荧光等技术，研究骨关节炎中特征性的炎症指标及相关炎症信号通路指标，进一步完善了骨关节炎的发病机制，并阐明了DUSP5在骨关节炎中的抗炎作用及其机制，试图为骨关节炎的治疗提供新的思路。
本研究将分为以下3个部分：
1．DUSP5在OA病人软骨组织及体外大鼠软骨细胞诱导炎症后的表达情况；
2．DUSP5在大鼠体外、体内骨关节炎模型中对炎症的调控作用；
3．DUSP5在骨关节炎中的抗炎作用机制研究。
第一章DUSP5在OA病人软骨组织及体外大鼠软骨细胞诱导炎症后的表达情况
研究目的：
研究DUSP5在OA病人和正常人间的表达差异及体外大鼠软骨细胞诱导炎症后的表达情况。
研究方法：
在浙江大学医学院附属第二医院滨江院区关节外科，收集了髋OA病人及股骨颈骨折病人全髋关节置换手术过程中废弃的髋关节软骨组织各6例。通过番红-固绿染色研究OA病人和正常人软骨组织蜕变情况，然后通过组织免疫荧光、western-blot技术研究人体软骨组织中DUSP5的表达情况。此外，应用10ng/mL的IL-1β刺激离体培养的大鼠软骨细胞构建骨关节炎细胞模型，探究DUSP5表达情况与IL-1β作用时间及浓度的关系。
结果：
番红-固绿染色结果表明OA病人的软骨组织磨损、退变情况比正常人显著，组织免疫荧光结果及western-blot结果均显示，与正常人软骨组织相比，在OA病人髋关节软骨组织中，DUSP5处于显著低表达的水平(P＜0.05)。体外OA模型中，随着IL-1β浓度的提高，DUSP5的表达水平也逐渐升高，在10ng/mL的IL-1β刺激下，随着作用时间的延长，DUSP5的表达也随之升高。
结论：
DUSP5在人OA软骨组织中呈显著低表达，而短时间内，在离体培养的大鼠软骨细胞骨关节炎模型中，DUSP5的表达随IL-1β浓度的升高而升高，随IL-1β作用时间的延长呈现出正相关。我们猜测，短时间内炎症刺激如IL-1β会诱发DUSP5的表达，但骨关节炎是一个长期慢性进展的疾病，长期炎症刺激可能会抑制DUSP5的表达，同时有研究发现，DUSP5蛋白是短时程蛋白(short-lived protein)，在细胞核内无法长期稳定存在，易被泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system, UPS)降解，这或许可以解释人OA软骨组织中为什么DUSP5呈低表达，但需要做进一步的研究。
第二章DUSP5在大鼠体外、体内骨关节炎模型中对炎症的调控作用
研究目的：
探究DUSP5在大鼠体外及体内骨关节炎模型中对软骨炎症反应的调控作用。
研究方法：
在离体培养的大鼠软骨细胞中，分别应用小干扰RNA(Small interfering RNA, siRNA)和DUSP5基因过表达慢病毒载体技术，构建DUSP5敲低或者过表达的大鼠软骨细胞，应用QRT-PCR、western-blot等检测技术，通过检测骨关节炎特征性的炎症指标MMP3、MMP9、MMP13、COX2、iNOS等的mRNA及蛋白表达情况，分别研究了DUSP5低表达和高表达对IL-1β介导的离体大鼠软骨细胞炎症反应的影响。在体内实验中，通过对大鼠膝关节实施内侧半月板切除术(destabilization of the medial meniscus, DMM)构建大鼠膝关节OA模型，从DMM手术完成后1周开始，通过往大鼠关节腔内注射慢病毒的方式，构建DUSP5敲低或者过表达模型(每2周注射1次，共注射2次)。50只大鼠随机分成5组，每组10只：Sham组设置为空白对照组，进行DMM假手术，术后往大鼠关节腔内注射无菌PBS；Len-OE为过表达组，术后往大鼠关节腔内注射等量DUSP5过表达慢病毒；Len-NC作为过表达实验的对照组，术后往大鼠关节腔内注射等量的过表达对照慢病毒；Sh-KD为敲除组，术后往大鼠关节腔内注射等量DUSP5敲除慢病毒；Sh-NC为敲除实验的对照组，术后往大鼠关节腔内注射等量的敲除对照慢病毒。造模后5周处死大鼠，取膝关节软骨组织进行QRT-PCR，检测DUSP5的表达情况，验证敲除和过表达效率。取大鼠膝关节固定、脱钙后的切片进行番红-固绿染色、组织免疫荧光，检测软骨磨损、退变情况及炎症指标表达情况。
结果：
在体外实验中，敲低实验显示，使用siRNA可以有效降低大鼠软骨细胞DUSP5的mRNA及蛋白表达水平(P＜0.05)，QRT-PCR结果显示，敲低DUSP5后，IL-1β刺激24h可以显著提高大鼠软骨细胞内的炎症特异性基因iNOS、COX2、MMP9、MMP13和MMP3的mRNA表达(P＜0.05)，同样的，western-blot实验结果表明，敲低DUSP5后，IL-1β刺激24h显著地增强了大鼠软骨细胞内的炎症特异性基因iNOS、COX2、MMP13蛋白表达(P＜0.05)。
而过表达实验显示，使用过表达慢病毒可以有效提升大鼠软骨细胞DUSP5的mRNA及蛋白表达水平(P＜0.05)，QRT-PCR结果显示，过表达DUSP5可以有效抑制IL-1β诱导24h下的大鼠软骨细胞内的炎症特异性基因iNOS、COX2、MMP9、MMP13、MMP3的mRNA的表达(P＜0.05)，western-blot结果显示，过表达DUSP5可以显著地降低IL-1β刺激24h后的大鼠软骨细胞内的炎症特异性基因iNOS、COX2、MMP13、MMP9蛋白表达(P＜0.05)。
在大鼠的体内实验中，我们运用QRT-PCR技术对大鼠膝关节软骨组织中DUSP5表达水平进行测定，结果显示，运用敲除或者过表达慢病毒进行关节腔注射，可以有效敲低或者过表达DUSP5(P＜0.05)。此外，我们对大鼠的膝关节进行切片，然后对切片进行番红-固绿染色实验和组织免疫荧光实验，结果显示，过表达DUSP5后，大鼠膝关节软骨磨损情况及退变程度显著低于对照组，同时炎症蛋白COX2的表达水平也显著低于其对照组，而敲低DUSP5后，大鼠膝关节软骨磨损情况和退变程度均显著高于对照组，炎症蛋白COX2的表达水平也显著高于其对照组。体外实验和体内实验结果一致，均可以有效说明DUSP5在骨关节炎中具有一定抗炎作用。
结论：
DUSP5对大鼠软骨具有保护作用，在软骨炎症反应及骨关节炎病理过程中具有一定抗炎作用。
第三章DUSP5在骨关节炎中的抗炎作用机制研究
研究目的：
探究DUSP5在骨关节炎中的抗炎作用机制。
研究方法：
在离体培养的大鼠软骨细胞中，分别应用小干扰RNA(Small interfering RNA, siRNA)和DUSP5基因过表达慢病毒载体技术，构建DUSP5敲低或者过表达的大鼠软骨细胞，依据参考文献，使用IL-1β刺激10min构建该部分实验所需模型，应用western-blot技术检测NF-κB通路中的p65、p-p65蛋白表达情况及MAPK通路中的erk、p-erk蛋白表达情况，同时应用细胞荧光技术检测p65的入核情况，研究DUSP5在骨关节炎中的抗炎作用机制。此外，在DUSP5敲低实验中，进一步设计挽救实验，在IL-1β刺激大鼠软骨细胞之前，分别使用QNZ(NF-κB信号通路的特异性抑制剂)和GDC(ERK1/2信号通路特异性抑制剂)特异性阻断相应的信号通路，然后通过western-blot实验检测大鼠软骨细胞中炎症特异性蛋白iNOS、COX2和MMP9的表达水平。
结果：
使用siRNA敲低大鼠软骨细胞DUSP5表达水平后，IL-1β刺激10min后，western-blot结果显示p-p65、p-erk表达显著升高(P＜0.05)，细胞荧光显示p65入核比对照组显著增多，表明敲低DUSP5后，IL-1β可以诱导更高活性的NF-κB和ERK1/2通路的表达。IL-1β刺激10min条件下，western-blot结果显示DUSP5过表达的大鼠软骨细胞中p-p65、p-erk表达显著减少(P＜0.05)，细胞荧光显示p65入核比对照组显著减少，表明过表达DUSP5后，IL-1β诱导的NF-κB和ERK1/2通路的表达被有效抑制。在挽救实验中，IL-1β刺激大鼠软骨细胞之前，分别使用QNZ(NF-κB信号通路的特异性抑制剂)和GDC(ERK1/2信号通路特异性抑制剂)特异性阻断相应的信号通路后，western-blot结果显示，IL-1β刺激敲低DUSP5的软骨细胞所引起的iNOS、COX2、MMP9的高表达均可被有效抑制(P＜0.05)，这进一步说明，DUSP5在软骨细胞炎症反应中所起到的抗炎作用确实是通过抑制NF-κB和ERK1/2信号通路来实现的。
结论：
在大鼠软骨细胞炎症和骨关节炎中，DUSP5的抗炎作用是通过抑制NF-κB和ERK1/2信号通路实现的。