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背景早在先秦时代我国已有限食的实践。根据限食的严格程度,分为轻度限食和深度限食。轻度限食在西方国家比较流行,除了可以改善肝脏[1]、脑[2]、肌肉[3]、心脏[4]等脏器功能,还可以降低血糖、血压、血脂水平,增强机体抵抗力,抑制机体炎症反应[5-7]。但轻度限食历时长,通常数月以上才能取得明显的成效,有些还需要食用模拟轻度限食的功能食品辅助,不但见效慢,且成本高。关于轻度限食对血液系统的影响,已有的研究报道主要关注T细胞[8]等淋系细胞,轻度限食对红细胞的影响,目前尚未见报道。深度限食主要见于我国和亚洲一些国家的民间实践,对此鲜有循证研究报道。我们实验室开展了深度限食的人体干预研究,结果显示,深度限食（限食一周或二周）可因实际体况适应性地改善血脂、血小板和血管的生物学状况,降低血栓风险,而不影响血液的凝血功能[9]。我们还发现,短期的深度限食（限食三天）也能改善固有免疫功能[10]。红细胞是血液中含量最多的一类细胞。红细胞计数偏低是当前亚健康以及老龄人中重要的一个标志[11-13]。关于限食是否影响机体中红细胞的产生和功能,迄今尚无研究报道。短期深度限食是在短时间内（人3-7天,小鼠6小时-48小时）完全不进食,但不限制饮水。本课题研究短期深度限食对红细胞的影响,以期为运用短期深度限食指导非医疗健康干预,增强造血机能和身体健康,奠定理论基础。目的1.探究短期深度限食对机体红细胞数量和功能的影响;2.阐明短期深度限食影响红细胞生成的生物学机制。方法1.探究短期深度限食对人体的红细胞数量、形态和功能的影响。（a）通过血常规和流式细胞分析,探究短期深度限食对人体外周血和骨髓中红细胞数量的影响;（b）运用瑞-姬氏染色法,分析短期深度限食对人体红细胞形态的影响;（c）运用指夹式血氧仪检测血氧饱和度;（d）通过酶联免疫吸附测定试验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）分析2,3-二磷酸甘油酸（2,3-DPG）含量、血浆游离血红蛋白（Plasma free hemoglobin,pfHb）浓度、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase,GSH-PX）、过氧化氢酶（Catalase,CAT）和丙二醛（Malondialdehyde,MDA）的含量。2.探究短期深度限食对小鼠的红细胞数量、形态和功能的影响。（a）通过血常规和流式细胞分析,探究短期深度限食对小鼠外周血和骨髓中红细胞数量的影响;（b）运用瑞-姬氏染色法,分析短期深度限食对小鼠红细胞形态的影响;（c）运用ELISA检测2,3-DPG含量和pfHb浓度;（d）运用流式细胞术检测细胞凋亡水平（Annexin V标记）、活性氧含量（2,7-Dichlorodi-hydrofluorescein diacetate,DCFH-DA 标记）和线粒体数量（Mitotracker deep red 标记）。3.初步探究短期深度限食使红细胞数量增加的机制。（a）通过称重分析小鼠的脾脏系数;（b）通过流式细胞术分析骨髓中红细胞的数量、细胞凋亡比例、造血干祖细胞的数量、巨核系祖细胞（Megakaryocyticprogenitors,MKP）的数量;（c）通过集落形成实验（Colony-forming unit assay,CFU assay）分析造血干祖细胞在短期深度限食前后分化潜能的改变。4.通过巨核红系祖细胞（Megakaryocyte-erythroidprogenitors,MEPs）转录组学分析,筛选出短期深度限食促进红细胞生成的关键调控基因。（a）通过MEPs转录组学测序,筛选出短期深度限食促进红细胞生成的关键调控基因;（b）通过实时荧光定量 PCR（Real-timequantitative PCR,RT-qPCR）、慢病毒 RNA 干扰、流式细胞分析、免疫印迹等方法验证测序结果。5.验证MS4A3-CDK2轴调控短期深度限食引起的红细胞增多。（a）通过RT-qPCR检测小鼠在短期深度限食后Cdk2基因的表达;（b）通过流式细胞分析和免疫印迹分析MS4A3基因敲低细胞的CDK2蛋白表达和CDK2磷酸化修饰水平;（c）使用CDK2磷酸化抑制剂Roscovitine腹腔注射小鼠后,采用血常规分析和流式细胞分析检测小鼠外周血和骨髓中红细胞和MEPs的数量。6.在自噬功能被化学抑制的小鼠中,检测短期深度限食是否促进红细胞生成。（a）采用RT-qPCR和荧光共聚焦定位分析,检测小鼠MEPs在短期深度限食前后的自噬水平;（b）3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine,3-MA）腹腔注射小鼠后,通过RT-qPCR和免疫印迹检测小鼠的自噬是否被抑制;（c）通过血常规分析和流式细胞分析,检测自噬功能被抑制的小鼠外周血、骨髓中红细胞的数量。7.在自噬功能被遗传性破坏的小鼠中,检测短期深度限食是否促进红细胞生成。（a）采用免疫印迹和成像流式检测小鼠的自噬功能;（b）通过血常规和流式细胞分析,检测自噬功能缺陷小鼠外周血、骨髓中红细胞和MEPs的数量;（c）通过RT-qPCR检测自噬缺陷小鼠经短期深度限食后MEPs中Ms4a3和Cdk2基因的表达水平;（d）运用流式细胞术检测自噬缺陷小鼠在短期深度限食前后MEPs的细胞周期。8.检测短期深度限食影响红细胞生成是否依赖于促红细胞生成素（Erythropoietin,EPO）表达的上调。（a）采用RT-qPCR技术检测自由进食组和短期深度限食组小鼠肾脏中Epo转录水平;（b）采用ELISA检测各组小鼠血浆中EPO的表达;（c）运用流式细胞术检测不同浓度EPO处理的HUDEP-2细胞中MS4A3蛋白表达和CDK2磷酸化修饰水平。结果1.人体短期深度限食后,红细胞的数量增多,形态不变,功能增强。（a）短期深度限食后,人体外周血中红细胞的数量增多、血红蛋白浓度和红细胞比容升高;（b）人体短期深度限食后,红细胞的形态没有改变;（c）短期深度限食后,血氧饱和度和2,3-DPG含量不变;（d）短期深度限食后pfHb含量下降;（e）短期深度限食后,SOD、GSH-PX、CAT等抗氧化酶增多,脂质过氧化物的产物MDA下降。2.小鼠短期深度限食后,红细胞的数量增多,活力增强,抗氧化功能增强。（a）短期深度限食后,小鼠外周血中红细胞的数量增多、血红蛋白浓度和红细胞比容升高;（b）小鼠短期深度限食后,红细胞的形态没有改变;（c）老龄小鼠短期深度限食后,2,3-DPG浓度升高,pfHb浓度降低;（d）老龄小鼠短期深度限食后,骨髓的红细胞由细胞膜内外翻到膜外的磷脂酰丝氨酸减少、活性氧水平下降、线粒体数量增加。3.短期深度限食通过促进MEPs细胞增殖促进红细胞生成。（a）短期深度限食后,小鼠的脾脏外观、脾脏系数以及脾脏中红细胞的数量没有显著改变;（b）短期深度限食后,骨髓中红细胞的凋亡水平和增殖能力没有改变;（c）相比自由进食组,短期深度限食组小鼠骨髓中的MEPs显著增多,MKP的数量没有显著改变;（d）小鼠短期深度限食后,形成的红系集落数量显著增加。4.转录组学筛选出短期深度限食促进红细胞生成的关键调控基因是Ms4a3。（a）MEPs转录组学提示,短期深度限食后,Ms4a3基因显著下调;（b）RT-qPCR的结果进一步验证,小鼠短期深度限食后Ms4a3基因显著下调;（c）流式细胞分析和免疫印迹结果显示,MS4A3 shRNA慢病毒成功转导进HUDEP-2细胞中,MS4A3基因被成功敲低;（d）RT-qPCR和流式细胞分析结果表明,MS4A3基因敲低的细胞比对照组更多地分化为成熟红细胞。5.短期深度限食通过MS4A3-CDK2轴调控红细胞生成。（a）相比自由进食组,短期深度限食组小鼠的MEPs中Cdk2表达显著增加;（b）MS4A3基因敲低的细胞CDK2表达和CDK2的磷酸化程度较对照组相比显著增多;（c）CDK2磷酸化的抑制剂Roscovitine显著抑制小鼠MEPs的CDK2磷酸化水平;（d）MEPs细胞CDK2磷酸化水平被抑制的小鼠短期深度限食后,外周血中的红细胞数量、血红蛋白浓度和红细胞比容未发生显著变化,骨髓中的红细胞和MEPs数量未发生显著变化。6.在自噬功能被化学抑制的小鼠中,短期深度限食无法促进红细胞生成。（a）小鼠短期深度限食后,自噬关键基因Atg7,Lc3a,Lc3b,Beclin1的表达增加,自噬关键蛋白LC3和溶酶体关联膜蛋白1（LAMP1）共定位增加,表明功能性自噬增强;（b）3-MA腹腔注射小鼠后,自噬关键基因Atg7,Lc3a,Lc3b,Beclin1表达下降,自噬关键蛋白LC3Ⅰ无法转化为LC3 Ⅱ蛋白,细胞自噬被抑制;（c）细胞自噬被化学抑制的小鼠在短期深度限食后,外周血中红细胞的数量、血红蛋白浓度、红细胞比容以及骨髓中的红细胞数量没有显著改变。7.在自噬基因缺失的小鼠中,短期深度限食不能促进红细胞生成。（a）免疫印迹和成像流式结果显示,自噬关键基因敲除的小鼠构建成功;（b）自噬基因缺失的小鼠,短期深度限食后无法升高外周血中红细胞的数量、血红蛋白浓度和红细胞比容,骨髓中红细胞和MEPs的数量;（c）RT-qPCR结果显示,自噬缺陷的小鼠短期深度限食后,编码Ms4a3和Cdk2的基因表达未改变;（d）流式细胞分析结果表明,自噬缺陷的小鼠短期深度限食后,MEPs的细胞周期不变。8.短期深度限食感应轴MS4A3-CDK2的表达不依赖于EPO表达的上调。（a）自由进食组和短期深度限食组小鼠肾脏中Epo表达水平没有显著差异;（b）自由进食组和短期深度限食组小鼠血浆中EPO表达没有显著差别;（c）不同浓度EPO处理的HUDEP-2细胞,MS4A3和p-CDK2蛋白的表达水平没有显著差异。结论●人体和小鼠短期深度限食后,红细胞的数量增多且功能增强;●红细胞计数低的人体在短期深度限食后,红细胞的数量增加更显著;●短期深度限食通过促进MEPs自我更新促进红细胞生成;●MS4A3-CDK2轴是红系祖细胞感应短期深度限食促进红细胞生成的关键调控分子轴;●MS4A-CDK2调控红细胞生成轴感应短期深度限食依赖于细胞自噬功能但不依赖于EPO的表达上调。意义●本研究证明了短期深度限食在红细胞生成中的作用,阐明了短期深度限食通过促进MEPs细胞增殖,增强红细胞生成的生物学机制;●红细胞数量及功能下降与老龄化和很多疾病的发生发展相关。对老年人和老龄鼠短期深度限食后,红细胞的数量增加、功能增强,并趋近于年轻个体的状态。这些结果为运用短期深度限食指导非医疗健康干预,增强造血机能和身体健康,奠定了理论基础。