病毒性心肌炎(viral myocarditis, VMC)是一临床常见心血管系统疾病。早在1899年Fiedler KL就曾报道过3例现代概念的VMC,此后,欧美各国VMC的临床及尸检报道日益增多。20世纪70年代后,中国及日本等亚洲国家相继报道了VMC的发生,近年来尤其在我国,VMC的发病逐年上升,VMC已成为青少年不明原因猝死的主要原因之一。不仅如此,慢性VMC常可导致扩张性心脏病的发生,在美国每年新增扩张性心脏病病人多达100,000人,已成为心脏移植手术的重要原因之一。VMC严重危害生命健康,然而迄今为止,VMC的治疗尚无有效的办法,其根本原因在于VMC的发病机制还不完全清楚,因此,阐明VMC的发病机制具有重要的理论和实践意义。目前认为,VMC的发生是一个多因素参与的复杂的过程,病毒感染是VMC重要的病因之一。肠道病毒、巨细胞病毒、腺病毒、流感病毒、肝炎病毒等病毒感染都可以诱发VMC。其中肠道病毒尤其是柯萨奇病毒感染是最常见病因。B3型柯萨奇病毒(coxsackievirus group B type 3, CVB3),微小无衣壳正链RNA病毒,属于小核糖核酸病毒科。早在20世纪50年代,B3型柯萨奇病毒已被发现能累及心肌,导致VMC。流行病学调查中发现,CVB3感染在不同性别人群中发病率和严重程度明显不同,VMC在男性人群中多发,症状也较为严重,并易发展为慢性心肌炎和扩张性心肌病。与人类相似,CVB3感染的雌性和雄性BALB/c小鼠也显示不同严重程度的心肌炎。尽管CVB3感染的发病机制已经研究了很多年,但直到近来才发现多种机制参与了CVB3诱导的VMC的发生、发展和进程。CD4+T细胞的免疫偏移可以影响VMC严重性。一方面,Thl型免疫应答被认为是引起心肌组织损伤的主要原因：有研究发现,CD4基因敲除小鼠中CVB3诱导的VMC可以得到有效的缓解,证实了CD4+T细胞在VMC中的作用；Huber等也发现CD4+Thl细胞应答对于CVB3诱导的VMC是必需的。另一方面,CD4+调节性T细胞(regulatory T cells, Tregs)可以降低心肌炎症,缓解心肌炎的发病：Ono等发现,高表达GITR的Foxp3+ Tregs可以控制自身免疫性心肌炎；Huber等证实CVB3病毒突变体可以通过诱导和维持Tregs的数量,有效的缓解心肌炎。炎性细胞因子在VMC的发病过程中也发挥重要作用。在易感小鼠中,心肌组织中IL-1β和IL-18水平的增加直接与疾病的严重性呈正相关；在非易感小鼠中,IL-1或TNF-α却能促进心肌炎的发病。本室前期研究发现,外源性注射IL-4可以显著改善CVB3感染小鼠的心肌炎症和心肌炎的严重程度。因此,治疗CVB3诱导的VMC理想的方法就是促进细胞因子向抗炎因子转化,同时诱导或扩增抑制性细胞(?)CD4+ Tregs。Galectin-9,β半乳糖苷结合凝集素家族成员,可诱导嗜酸性粒细胞、肿瘤细胞和T细胞凋亡。通过Ca2+ -caspasel信号途径,galectin-9(?)(?)优先诱导活化CD4+T细胞发生凋亡。T细胞免疫球蛋白域和粘蛋白域蛋白-3(T-cell immunoglobulin domain and mucin domain protein-3, Tim-3), galectin-9的受体,选择性表达于终末分化Th1细胞,在Th17、Tregs表面也有一定的表达。Galectin-9在体内外均可以诱导Tim-3表达的细胞发生凋亡。有研究发现,galectin-9治疗可以有效的缓解实验性变态反应性脑炎,一种中枢神经系统脑炎。而且,在胶原诱导的关节炎动物模型以及HSV诱导的损伤模型中,galectin-9通过调节T细胞应答,如抑制Th17的产生,同时促进Tregs的分化和扩增,从而达到治疗疾病的目的。在本研究中,我们用CVB3感染的雄性BALB/c小鼠,观察CVB3感染后心肌中galectin-9的表达变化,结果显示CVB3感染后雄性BALB/c小鼠心肌galectin-9的表达显著升高。进一步研究发现galectin-9可以促进Tregs的富集,并有效的缓解CVB3诱导的VMC。那么galectin-9是通过什么机制缓解VMC的发作?是影响病毒复制还是通过调节细胞免疫应答?Galectin-9促进Tregs富集的机制又是什么?因此,在本研究中我们利用CVB3感染的VMC模型,探讨了galectin-9在VMC发病中的作用及相关机制。第一部分Galectin-9在病毒性心肌炎发病中的作用一、CVB3感染前后galectin-9的表达变化Galectins属于β半乳糖苷结合凝集素家族。现有的研究表明,galectins在各种生理或病理过程中发挥重要作用,如免疫炎症反应、肿瘤、动脉粥样硬化和糖尿病等。其中galectin-1,-3,-9在调节免疫应答和炎症反应中发挥重要作用。为了研究galectins在CVB3诱导的VMC中的作用,我们首先观察了CVB3感染前后小鼠心肌中galectin-1,-3,-9的表达变化,结果发现CVB3感染可以显著上调小鼠心肌galectin-1,-9 mRNA的表达。由于galectin-1在病毒感染中研究较为清楚,我们进一步关注了CVB3感染前后galectin-9在不同组织中的表达变化,发现CVB3感染后,小鼠心肌、脾脏和肠系膜淋巴结中galectin-9 mRNA的表达显著升高。免疫组化结果也显示CVB3感染增加了小鼠心肌中galectin-9蛋白的表达。上述结果提示,galectin-9可能参与了CVB3诱导的VMC的发病。二、Galectin-9治疗前后BALB/c小鼠病毒性心肌炎严重程度的差异VMC以心肌间质炎性细胞浸润为特征,导致心肌细胞灶性坏死,纤维化,最终导致心脏功能丧失。以CVB3感染小鼠建立心肌炎动物模型,很好地模拟了临床上VMC疾病过程。VMC的判断指标主要有体重减轻、血清学、病理学以及死亡率等。用galectin-9蛋白腹腔注射治疗CVB3感染雄性BALB/c小鼠,结果发现两组小鼠在感染后第3天体重都开始下降,其中未治疗组(PBS组)小鼠体重持续下降,至第7天体重减轻率达15%,而galectin-9治疗组BALB/c小鼠感染后第5天体重开始恢复,随后体重逐渐增加。从血清学指标来看,在感染后第7天,未治疗组BALB/c小鼠血清CK、CK-MB的活性显著升高,cTnI水平也明显升高；而galectin-9治疗组小鼠血清CK、CK-MB的活性和cTnI水平显著低于未治疗组小鼠。心脏组织HE染色显示未治疗组BALB/c小鼠心脏显示片状的炎性细胞浸润和心肌细胞坏死,而galectin-9治疗组小鼠心脏仅有少量炎性细胞浸润；治疗组小鼠心肌炎的炎症面积远小于未治疗组,而且治疗组小鼠心脏浸润CD45+单个核细胞比例显著降低。最后,从死亡率来看,至感染第10天,未治疗组BALB/c小鼠的死亡率高达70%,而galectin-9治疗组小鼠的死亡率仅为15%。综合上述各项指标可以看出,galectin-9治疗可以显著缓解CVB3诱导的VMC。三、Galectin-9治疗对CVB3感染小鼠炎症性细胞因子分泌的影响炎症性细胞因子如TNF-α、IFN-γ、IL-4和IL-10等在心肌炎的发病过程中发挥重要作用。因此,我们检测了galectin-9治疗对小鼠心脏局部和血清中炎性细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-4和IL-10分泌的影响,发现galectin-9治疗可以显著下调促炎性细胞因子TNF-a和IFN-y的分泌,同时促进抗炎性细胞因子IL-4和IL-10的分泌。以上结果显示,galectin-9可以有效的缓解CVB3诱导的VMC,并促进细胞因子微环境向抗炎性转化,证实galectin-9的确参与了VMC的发病。第二部分Galectin-9在病毒性心肌炎中的作用机制探讨一、Galectin-9对病毒复制的影响CVB3感染心肌细胞是诱发VMC的前提条件。由此我们必须排除一个可能即galectin-9缓解CVB3诱导的VMC是由于降低心肌病毒复制造成的。因此我们首先检测了galectin-9治疗前后CVB3感染的BALB/c小鼠心脏组织中CVB3病毒RNA数量和病毒滴度的变化,结果发现galectin-9并没有引起心脏组织中CVB3病毒RNA数量和病毒滴度的改变。二、Galectin-9对细胞免疫应答的影响由于galectin-9缓解VMC并没有降低心肌病毒复制,我们进一步探讨了galectin-9治疗对细胞免疫应答的影响。结果显示CVB3感染过程中,galectin-9可以显著降低小鼠心脏和脾脏中CD4+T细胞的比例,同时增加Tregs、CD11b+及Gr-1+细胞的数量。由于Tim-3 (galectin-9特异性受体)和TLR4的相互作用在VMC的发病过程中发挥重要作用,我们还检测了galectin-9对Tim-3和TLR4在免疫细胞表面表达的影响,发现galectin-9降低了CD4+T细胞Tim-3的表达,但其在巨噬细胞表面的表达显著升高；同时galectin-9显著降低了TLR4在CDllb+细胞及巨噬细胞表面的表达。上述结果提示,galectin-9缓解CVB3诱导的VMC并不是直接降低病毒复制,而是通过调节细胞免疫应答参与心肌炎的发病,Tregs和CD11b+细胞可能参与其中。前面的实验结果显示,galectin-9可以有效的缓解CVB3诱导的VMC,我们进一步探讨了其可能的细胞学机制以及是否这种作用依赖于效应T细胞数量的降低和Tregs数量的升高。三、Galectin-9对于CD4+T细胞凋亡和增殖的影响现有的研究表明,galectin-9可以优先诱导效应CD4+T细胞的凋亡,而在CVB3诱导的VMC模型中,分泌IFN-γ的CD4+T cells是影响疾病严重性的重要因素。因此,我们首先检测了galectin-9对CD4+T细胞凋亡的影响,发现galectin-9可以显著促进CD4+T细胞发生凋亡。进一步研究发现,galectin-9主要诱导CD4+CD2low/int效应T细胞凋亡(>90%),而对于CD4+CD25high Tregs的促凋亡作用甚微(<10%)。我们同时也检测了galectin-9对CD4+ T细胞增殖的影响,发现galectin-9能抑制CD4+T细胞增殖,并主要抑制CD4+CD25low/int效应T细胞的增殖,而并不影响CD4+CD25high Tregs的增殖。Galectin-9差异调节Tregs和效应T细胞凋亡和增殖可能是由于其受体Tim-3的表达差异造成的,相关机制仍需进一步研究。四、Galectin-9在诱导调节性T细胞分化中的作用Tregs在CVB3诱导的VMC的发病过程中发挥重要作用。为了探讨galectin-9是否影响Tregs应答,我们检测了galectin-9对Tregs分化的影响,发现galectin-9能促进CVB3感染的裸鼠心脏和脾脏中CD4+CD25-T细胞向Tregs转化。五、Galectin-9在扩增CDllb+ Gr-1+细胞中的作用前面的实验结果发现,galectin-9能显著增加CD11b+和Gr-1+细胞的比例,而CD11b和Gr-1是髓系来源抑制细胞(myeloid suppressor cells,MSCs)的特有表型,于是我们检测了galectin-9在调节CDl lb+Gr-1+细胞扩增中的作用,结果显示galectin-9能显著扩增CD11b+Gr-1+细胞。通过分析这群细胞的表型和细胞因子分泌情况,我们发现其具有髓系来源抑制细胞的表型。许多研究表明,髓系来源抑制细胞可以促进Tregs的扩增。因此,我们接着研究了CD11b+Gr-1+细胞在扩增Tregs中的作用,结果显示,CD11b+Gr-1+细胞可以促进CD4+T细胞中Tregs的扩增,这种作用部分依赖于IL-10,而不依赖于TGF-β。综上所述,本研究首次阐明了galectin-9在CVB3诱发的VMC发病中的作用；证实了galectin-9是通过调节细胞免疫应答参与了VMC的发病,并未影响病毒复制；多种机制参与了galectin-9对VMC的调节：Galectin-9差异调节效应T细胞和Tregs增殖和凋亡；CD11b+Gr-1+细胞的积累和Tregs的分化。本研究在一定程度上阐明VMC的发病机制,同时也为临床提供了一个有效的治疗靶点和理论支持。