表观遗传学(epigenetics)是研究在不改变DNA序列的前提下,通过某些机制产生可遗传的基因或蛋白表达的变化,这些机制包括DNA修饰(DNA modifications)、组蛋白修饰(histone modifications)、RNA修饰(RNA modifications)、非编码RNA(non-coding RNA)调控和染色质重构(chromatin remodeling)等。组蛋白的翻译后修饰(PTMs)包括乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等,它们构成“组蛋白密码”(histone code),在表观遗传水平调控生命活动,其中研究的比较多的是组蛋白上赖氨酸的甲基化修饰。负责甲基化修饰的是一组含有SET结构域的蛋白,称为赖氨酸甲基转移酶(KMTs),它们可以将SAM上的甲基转移到组蛋白的赖氨酸的ε-氨基上,使不同组蛋白的不同赖氨酸上发生单、双、三甲基化修饰,进而调控基因表达。近些年,发现有些赖氨酸甲基转移酶除了可以甲基化组蛋白外,也可以甲基化非组蛋白。非组蛋白赖氨酸甲基化修饰会影响非组蛋白的亚细胞定位、蛋白质稳定性、蛋白质间的相互作用以及蛋白质本身的活性。与组蛋白修饰间的“交叉对话”一样,非组蛋白赖氨酸上的甲基化修饰也会与蛋白质上的其他修饰间发生“交叉对话”,形成精细的调控网络,影响生命活动。目前非组蛋白赖氨酸甲基化修饰酶只局限于少数几个甲基转移酶,如SETD7、EZH2、G9a、SETD2等,并且已发现的非组蛋白底物也非常有限,有更多的非组蛋白甲基化修饰有待挖掘。Plk1(Polo-like kinase 1)蛋白是一个细胞周期蛋白激酶,它在细胞周期中发挥着重要作用,尤其在有丝分裂期。从分裂前期到分裂末期,Plk1蛋白通过磷酸化一系列下游底物,调控着有丝分裂的起始、中心体的形成和成熟、纺锤体的形成、着丝粒与微管的结合、染色质的分离以及胞质分离等多种细胞活动。此外,Plk1蛋白在DNA的复制中也发挥作用。大量研究结果表明,Plk1在各种肿瘤中高表达,影响了细胞增殖和凋亡。在癌细胞中抑制Plk1激酶活性时,细胞分裂受阻,细胞增殖减慢并发生凋亡。另外,降低Plk1的表达会增加癌细胞对抗癌药物和放射治疗的敏感性,预示其可以作为癌症治疗的靶标。但现有的小分子抑制剂在临床上治疗癌症效果并不是很好,新的治疗方法有待开发,这就需要对Plk1的调控机制有更深入的研究。Plk1发挥功能时,需要Bora蛋白将其折叠自抑制的结构打开,Aurora A磷酸化其210位苏氨酸,以充分激活其酶活性进而磷酸化下游底物。在细胞分裂后期,Plk1被后期促进复合物APC/C介导的泛素化降解。此外,E3连接酶复合体CUL3/KLHL22对Plk1的泛素化,帮助了Plk1从着丝粒上解离。除了上述的磷酸化和泛素化修饰,Plk1是否存在其他的翻译后修饰形式,目前尚无报道。为探究Plk1是否存在其他形式的翻译后修饰,我们通过质谱鉴定发现Plk1上存在K209位赖氨酸的一甲基化修饰。通过肽段的体外甲基化实验及Dot blot检测方法,用制备的Plk1蛋白K209位的一甲基化修饰(K209me1)抗体筛选到G9a是负责该位点修饰的甲基转移酶。进一步的研究发现,Plk1蛋白的K209me1与T210的磷酸化(T210p)之间相互拮抗,二者之间存在“交叉对话”:Plk1K209me1会抑制Aurora A激酶介导的T210p,反过来T210p也会抑制G9a介导的K209me1。为了研究Plk1 K209me1对其蛋白质功能的影响,我们通过构建模拟甲基化修饰的点突变体K209M,发现K209M延迟了细胞进入M期的时间进程。此外,我们通过CRISPR-Cas9技术构建了Plk1基因K209M敲入突变的细胞系,通过细胞同步化结合时间点追踪实验,发现K209M确实比野生型细胞滞后进入M期。在显微镜下实时监测细胞分裂,发现K209M细胞比野生型细胞在从有丝分裂中期到有丝分裂后期的时间进程大大延长,染色体在赤道板停留时间较长,姐妹染色单体分离受阻。我们通过细胞分裂期纺锤体检验点激活、拉力强度分析和染色体核型分析发现,K209M染色体分离受阻很可能是由于Plk1活性下降导致的染色体间黏连蛋白复合物解离受阻。此外,我们意外地发现Plk1蛋白也可以磷酸化G9a蛋白,两个蛋白质之间也形成了“交叉对话”。质谱鉴定到Plk1可以磷酸化G9a的SET结构域中的T1045位点。与Plk1在M期蛋白水平和激酶活性最高相一致,G9a T1045磷酸化水平(T1045p)在细胞M期较高。我们还发现T1045p减弱了G9a甲基化底物的能力。通过结构分析发现T1045位于G9a结合SAM的关键氨基酸周围,并且与关键氨基酸M1048及G1049都可以形成氢键,可能稳定了G9a结合SAM的能力。Plk1对G9a T1045的磷酸化很可能破坏了上述氢键,减弱了G9a与SAM的结合,进而抑制了G9a甲基化下游底物的能力。综上所述,我们不仅发现了Plk1蛋白上相邻两位点修饰间的“交叉对话”,也发现了Plk1蛋白与G9a两蛋白之间的“交叉对话”,并且发现了它们功能之间的相互影响。本论文实验结果揭示了两个重要蛋白质的新的调控机制,帮助我们更好地了解了非组蛋白翻译后修饰及其在生命活动中的作用,为进一步研究蛋白质的功能及在疾病的治疗方面的应用提供了理论基础和应用前景。