【摘 要】
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通过大量的应用和探索,人们逐渐认识到线粒体基因组（mitochondrial DNA,mtDNA）异质性不仅发生在种群和个体之间,还普遍存在于组织、细胞间和细胞内。D-loop区域作为mtDNA的非编码区,是mtDNA分子进行复制和转录的调控枢纽,其高突变性被证明和很多疾病密切相关。与批量测序相比,单细胞测序数据能够还原批量测序中观测不到的低频变异信息,并且通过细胞条形码准确计数。液滴微流控通过产
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（61971125）；
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通过大量的应用和探索,人们逐渐认识到线粒体基因组（mitochondrial DNA,mtDNA）异质性不仅发生在种群和个体之间,还普遍存在于组织、细胞间和细胞内。D-loop区域作为mtDNA的非编码区,是mtDNA分子进行复制和转录的调控枢纽,其高突变性被证明和很多疾病密切相关。与批量测序相比,单细胞测序数据能够还原批量测序中观测不到的低频变异信息,并且通过细胞条形码准确计数。液滴微流控通过产生彼此隔绝的液滴,将样品中的细胞以单细胞的形式分装在液滴之中,实现大规模单细胞测序文库构建。然而,现有的基于液滴的细胞标记和文库构建步骤繁琐,需要多步液滴操控,液滴发生破乳的概率叠加,有效液滴比例低,串码发生概率高,基于转座酶对mtDNA可及性的特点进行的序列采样也存在不均匀的现象。针对上述问题,本课题利用琼脂糖凝胶在液滴操控中的优越特性,通过PCR预扩增产生带条形码序列的D-loop区域扩增引物,用于扩增单细胞mtDNA的D-loop区域同时实现大规模单细胞编码,开发了一种液滴操纵步骤少、细胞标记容量高、成本可控的单细胞线粒体D-loop区域异质性检测技术。主要研究内容及结果如下:1.液滴微流控平台搭建和单克隆多拷贝条形码液滴的制备设计了包含定位区和编码区的4+12N加长型条形码序列的D-loop区域扩增引物,将单分子的D-loop区域扩增引物作为模板在液滴进行第一轮数字液滴PCR（digital droplet PCR,ddPCR）,从而获得包含单克隆多拷贝扩增引物的单细胞编码液滴。经优化后的液滴体系展现出较高的温度稳定性,PCR前液滴平均直径22.92 μm,变异系数3.69%,PCR后液滴平均直径23.42 μm,变异系数4.58%,阳性液滴（包含单克隆多拷贝扩增引物）与阴性液滴（不包含单克隆多拷贝扩增引物）比例符合预期,破乳后电泳条带显示正确。2.单细胞琼脂糖凝胶液滴的生成和“一对一”的液滴配对融合将单个细胞包裹于琼脂糖凝胶液滴,与前期生成的包含单克隆多拷贝扩增引物的单细胞编码液滴“一对一”配对融合。采用低熔点琼脂糖凝胶作为液滴中细胞的固相介质,K562细胞系作为研究对象,特别设计“细长型”层流芯片用于辅助单细胞琼脂糖凝胶液滴的生成。在相同的微球输入浓度下,层流芯片和经典流动聚焦芯片相比单微球包裹率提高121.3%,多微球包裹率降低64.6%,实现超泊松分布。在此基础上生成单细胞琼脂糖凝胶液滴,液滴的平均直径29.65 μm,变异系数5.51%。固化后的凝胶珠方便进行裂解、洗涤、保存。将条形码液滴和凝胶珠重生成液滴进行“一对一”配对融合,经过直径统计得出液滴融合的成功率达 64%。3.大规模单细胞编码和混合样本的串码分析经过液滴融合,再通过第二轮ddPCR反应将条形码序列引入扩增产物,实现大规模单细胞编码和D-loop区扩增。产物进行挑克隆测序,经过序列比对,所有克隆序列均匹配上参考序列,并且文库结构完整可用于二代测序。使用人（K562）和小鼠（BALB/3T3 clone A31）的混合样本进行样本的串码分析。结果表明,可能由于液滴破乳、mtDNA少量逸出凝胶外等原因,实验中存在一定的背景扩增,经过统计背景扩增数据占7.48%。4.单细胞D-loop区域异质性研究在K562单细胞D-loop异质性数据中,我们设置过滤条件为每一个单细胞下ReadPairs占比不低于1%且数量不低于30条,以便可靠去除背景扩增数据。通过GATK软件找寻异质性来源,我们发现在所有的细胞中都存在异质性。经过统计得到22种mtDNA的类型（mtDNAtype）,其中mtDNAtype 1占 75.56%,并且在 95.52%的细胞中mtDNAtype 1都占主导;99.07%的细胞含有4种及以上的mtDNAtype。在MITOMAP中搜索所有发生的突变,发现T293G、C306A和C377A为未报告的新突变。并且所有Del（删除）都集中在D310区,可能指示D310多态性和骨髓性白血病相关。因此,本课题开发的单细胞线粒体D-loop区域异质性检测技术在单细胞测序领域展现出强大的潜力,对实现D-loop异质性诊断和解决线粒体疾病和相关癌症时可以提供新的手段。
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