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目的: 观察白花丹的药用活性成分白花丹醌对HSEC细胞的作用,了解该药对HSEC细胞的微观结构及分泌功能的影响,观察该药对肝窦毛细血管化及纤维化相关因子表达水平的干预,并进一步探究其抗肝纤维化及活血化瘀的药理作用及靶位点。为白花丹的抗肝纤维化作用提供重要的科学依据,为开发利用盛产于广西的民族药白花丹治疗肝纤维化作出理论和实验的铺垫。 第一部分 方法: (1)动物模型:二甲基亚硝胺、小牛血清白蛋白和去甲肾上腺素注射液联合注射,外加乙醇灌胃及高脂低蛋白饲料喂养,多因素联合构建血瘀证肝纤维化模型。造模结束观察大鼠的死亡率、中医血瘀证证候、证候等级评分、肝脏病理学大体形态、肝功能改变,以及免疫组化法染色观察I型和III型胶原、α-SMA三种胶原蛋白的表达水平、放射酶免法血清学检测大鼠肝纤维化四项——HA、P3NP、LN、CⅣ的含量。将以上结果与传统CCl4单因素造模法进行比较。 (2)细胞模型:胶原酶灌注分离、梯度离心纯化及培养大鼠HSEC细胞株。 结果: (1)动物模型:①复合多因素模型组大鼠的死亡率为20%;②模型大鼠出现瘀斑、舌紫暗、便溏等典型的中医血瘀证证候,血瘀证证候等级评分高;③病理学大体形态观察发现肝脏出现表面暗白、密布灰白结节、质硬脆等纤维样变化;④血清学肝功能检测发现模型大鼠的ALT和AST,以及TBIL、DBIL及IBIL的含量均显著上升;⑤免疫组化法染色发现I型和III型胶原、α-SMA三种胶原蛋白的表达水平显著增高;⑥大鼠的血清肝纤维化四项——HA、P3NP、LN、CⅣ的含量均显著上升。⑦血瘀证模型组的以上各项结果(除了死亡率及肝功能外)经对比均高于CCl4模型组,经统计学分析均有差异(p<0.05)。 (2)细胞模型:扫描电镜及透射电镜观察到细胞株的血窦、窗孔、基底膜等HSEC的特异性结构;CK19单抗免疫荧光法鉴定第Ⅲ代培养细胞的生物学特性,发现红色荧光物质定位于细胞质及细胞膜,95%以上的细胞的胞质区显示CK19阳性。 结论: (1)复合多因素造模方法能有效地改善CCl4造模法的高死亡率缺点;模型动物同时具备了疾病与证候双重特征,既符合中医血瘀证证候的基本特点,又与西医肝纤维化病理特征相一致。 (2)血窦、窗孔、基底膜等HSEC的特异性结构的出现,以及CK19单抗免疫荧光法鉴定结果均表明,从大鼠肝组织中分离得并培养的细胞确是肝窦内皮细胞,且纯度较高。 第二部分 方法: 以病证结合肝纤维化大鼠(动物模型)及瘦素激活的HSEC(细胞模型)作为研究模型,以高、中、低浓度白花丹醌作为干预对象,以秋水仙碱和丹参酚酸B作为阳性对照。动物模型药物干预2wk,细胞模型药物孵育48h后,分别制作组织和细胞电镜标本;扫描电镜观察HSEC细胞的血窦和窗孔的开放情况;透射电镜观察细胞窗孔的开放数量及面积,以及细胞外基底膜的形成情况。 结果: (1)肝纤维化的病变程度与窗孔的数量及面积成反比关系;肝纤维化程度越高,窗孔数量越少,孔径越小;而肝纤维化程度越高,基底膜的形成越完整,甚至连接成片。 (2)白花丹醌能使关闭或消失了的窗孔明显增多,孔径增大;使细胞外基质沉积形成的基底膜变薄和减少,从而降低了肝窦内皮毛细血管化的程度。并且上述干预作用呈现白花丹醌的药物剂量依赖性。 结论: 肝纤维化的病变程度与窗孔的数量、面积及基底膜的形成有直接相关性;民族药白花丹醌能够通过使窗孔明显增多和增大,使细胞外基底膜变薄和减少,降低肝窦内皮毛细血管化的程度,以此为靶点改善肝脏的微循环障碍,进而使肝纤维化程度明显降低。并发现白花丹醌在一定范围的浓度内,给药剂量越高,干预肝窦内皮毛细血管化进程的能力越强。 第三部分 方法: 培养HSEC细胞株并分为7组:空白对照组(A组)、瘦素激活细胞模型组(B组)、白花丹醌高浓度组(C1组)、中浓度组(C2组)、低浓度组(C3组)、秋水仙碱阳性对照组(D组)、丹参酚酸B阳性对照组(E组)。培养孵育48h后,用免疫荧光法检测ET-1、VEGF、ColⅣ和LN四种肝纤维化相关的细胞因子在各组HSEC细胞上的表达定位、范围及强度;用RT-PCR法检测HSEC的上述四个细胞因子mRNA的表达水平(转录水平);用ELISA法检测HSEC的上述四个细胞因子的表达水平(蛋白翻译水平)。 结果: (1)免疫荧光鉴定结果显示,源自HSEC细胞的ET-1和VEGF两种蛋白的表达定位于细胞质及细胞膜上,表达均匀而弥散;而ColⅣ和LN两种蛋白的表达除了在细胞质内,较多的位于细胞膜周围密集表达。 (2)与空白对照组(A组)相比,B、C1、C2、C3、D和E各干预组的HSEC细胞的ET-1、VEGF、ColⅣ和LN四种细胞因子的荧光显色的范围及强度、mRNA的表达水平、蛋白的表达水平均有明显上升;差异有统计学意义(p<0.05)。 (3)瘦素激活模型组(B组)HSEC细胞的ET-1、VEGF、ColⅣ和LN四种细胞因子的荧光显色的范围及强度、mRNA的表达水平、蛋白的表达水平较A组相比均出现明显增高,而且上述表达水平在各组中均处于最高;经统计学分析差异均有高度显著性(p<0.01)。 (4)C1、C2、C3、D和E各药物干预组HSEC细胞的ET-1、VEGF、ColⅣ和LN四种细胞因子,其荧光显色的范围及强度、mRNA的表达水平、蛋白的表达水平与瘦素激活模型组(B组)相比均有明显降低,经统计学分析有显著性差异(p<0.01),可见各药物对HSEC细胞蛋白转录和翻译的干预均出现了明显的效果。 (5)白花丹醌高、中、低剂量组(C1、C2、C3组)HSEC细胞的ET-1、VEGF、ColⅣ和LN四种细胞因子的荧光显色的范围及强度、mRNA的表达水平、蛋白的表达水平较B组相比均出现了明显降低(但仍高于正常对照A组),p<0.05;而且随着给药浓度上升,可观察到C3、C2、C1组各蛋白的上述表达水平均出现了梯度下降(p<0.05),可见药物白花丹醌抑制HESC细胞纤维化相关蛋白的转录和翻译的作用有剂量依赖性。 (6)阳性药物对照D组和E组HESC细胞的ET-1、VEGF、ColⅣ和LN四种细胞因子,其荧光显色的范围及强度、mRNA的表达水平、蛋白的表达水平与瘦素激活模型组(B组)相比,均有明显降低(p<0.01);但是高剂量白花丹醌组(C1组)的上述表达水平均明显低于D组和E组(p<0.05),可见高剂量的白花丹醌对HESC纤维化细胞蛋白转录和翻译水平的干预强度大于治疗剂量的秋水仙碱和丹参酚酸B。 结论: (1)民族药白花丹醌可以在转录和翻译两层面明显降低激活的HSEC细胞的致纤维化细胞因子ET-1和VEGF的合成及分泌量;并降低细胞外基底膜的主要成分ColⅣ和LN的表达水平。从以上两方面呈现其干预肝纤维化病程的能力。该药的上述能力均具有剂量依赖性。 (2)高剂量的白花丹醌在改善HSEC细胞的肝窦毛细血管化现象,及抑制ET-1、VEGF、ColⅣ和LN等纤维化相关因子的合成及分泌水平方面所显示的能力,明显比治疗剂量的秋水仙碱和丹参酚酸B强。