过量合成5-氨基乙酰丙酸工程菌的构建

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5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid ALA)是一种光动力化合物。在医学上,ALA用于癌症的光动力学治疗和诊断,具有促进血红素生成的作用,是痤疮治疗的外用药,并且可以作为生发剂使用;在农业上,ALA是一种绿色无公害的除草剂、杀虫剂、抗微生物药剂和植物生长促进剂,具有促进植物生长,对害虫、致病菌高效,对人畜无毒、对环境无污染等优点,在生物农药和肥料领域具有广泛的应用前景。与化学合成法相比生物合成法生产ALA,工艺简单,生产原料低廉,可减少环境污染。基于生物合成法的优势及ALA广泛的应用前景,本论文主要对5-氨基乙酰丙酸的生物合成展开研究,包括ALA合成酶基因(hemA)的克隆、表达,工程菌发酵条件的优化以及运用代谢工程原理和技术构建具有新的ALA生物合成途径的大肠杆菌工程菌。主要实验结果如下:(1)从筛选得到的光合菌中,克隆了ALA合成途径中的关键酶ALA合成酶的基因(hemA),测序结果表明该基因长度为1224 bp。与NC007493 USA Rhodobacter sphaeroides进行比对,发现有一个碱基的差异(第1204位点由C突变为T),一致性为99.92%。将基因序列翻译为氨基酸序列进行比对,有一个氨基酸的差异(第335位由丙氨酸变为缬氨酸),一致性为99%(2)构建了原核表达载体pET30a-hemA,转化至宿主菌E.coli BL21(DE3)中,进行诱导表达,SDS-PAGE电泳检测结果显示,pET30a-hemA诱导后表达出的蛋白分子量约为45 kDa,与理论相对分子质量(44.7 kDa)相符,说明该蛋白诱导表达成功。(3)对pET30a-hemA/E.coli BL21(DE3)的发酵培养基和培养条件进行了优化,确定了最优培养基为TB培养基,最佳诱导温度为16℃,同时添加前体物质甘氨酸和琥珀酸终浓度均达到100 mM有助于菌体生长和ALA的合成,ALA的产量达到528 mg/L。(4)采用代谢工程策略,以大肠杆菌为宿主,系统考虑ALA C4生物合成途径的限速步骤、前体供给及产物分泌等问题,对ALA合成酶基因(hemA)、辅酶A转移酶基因(Cat)以及ALA分泌基因(YBi)进行基因操作,借助pETDuet-1共表达载体,构建了一株共表达hemA、Cat和YBi基因的工程菌E.coli ACY,胞外ALA的产量达到1124mg/L。
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