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糖尿病是由于体内胰岛素(insulin)绝对或相对分泌不足而引发的以高血糖为特征的慢性、全身性代谢疾病,因而胰岛素是治疗糖尿病的特效药物。传统的由动物组织提取或微生物发酵的方法生产胰岛素存在一些不足。近年来人们发现利用植物反应器生产胰岛素有一定优势,但也存在副产物过多、纯化困难的问题。本文在对人胰岛素原基因进行改造的基础上,探讨以模式植物拟南芥为材料、利用植物油体表达系统生产重组人胰岛素原,具体工作如下。
1.从沪油15油菜(Brassica nape cv.Huyou15)中克隆油体(oleosin)启动子和油体蛋白基因(BN-V)。按植物偏爱密码子设计合成256 bp人胰岛素基因(mins),并将其连接于oleosin基因(OG)下游构建融合基因。为便于外源蛋白检测和纯化,在mins基因前端引入6个组氨酸的his-tag,并最终构建成植物种子特异性表达载体pCAMBIA2300-op::og-hmins(ohmins)。
2.利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV301介导通过花粉管通道法转化哥伦比亚型拟南芥(Arabidopsis thaliana),经卡那抗生素(100 mg·L-1)培养基筛选,获得了15株抗性苗,经PCR检测获得12株阳性植株。
3.选取其中5株进行Southern blot杂交,结果显示目的基因已经整合到拟南芥基因组中,拷贝数为1～4个。
4.实时荧光定量PCR结果表明目的基因(ohmins)在拟南芥中成功转录。
5.SDS-PAGE和Westem杂交结果证明外源蛋白在拟南芥种子中已经成功表达。
6.ELISA结果显示,靶基因ohmins在转基因拟南芥种子中蛋白表达量占总可溶性蛋白(TSP)0.01～0.04％。
本研究成功构建了植物油体表达载体,通过农杆菌介导法转化获得转ohmins基因拟南芥,并且ohmins基因在转录和翻译水平均成功表达,为后续利用植物(油菜)油体系统表达胰岛素研究奠定了必要的前期基础。