我国水产养殖业快速发展的同时，相关的病原微生物防控任务也日益加剧。本研究针对病原微生物检测过程中存在的困难以及市场需求，选取桃拉病毒(Taura syndrome virus，TSV)和嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）为研究对象，对桃拉病毒的完整基因组进行生物信息学分析，并根据保守序列设计引物，建立了一种快速检测TSV桃拉病毒的环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）联合横向流动试纸条(Lateral flow dipstick，LFD)的方法(LAMP-LFD)，探讨了LAMP-LFD技术与实时荧光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR，qPCR)的优劣性。针对嗜水气单胞菌，建立了免疫磁珠富集与荧光定量PCR联合检测的方法。通过结合免疫磁珠富集的优越性，优化了其反应体系，评价了其检测特异性、灵敏度等性能，阐述了结合免疫磁珠的优越性。本研究将会对致病微生物的快速检测提供技术支持。具体研究内容如下:
　　(1)桃拉病毒的生物信息学分析。对桃拉病毒(Taura syndrome virus,TSV)的完整基因组进行生物信息学分析。通过生物信息学软件分析了，包括其基因序列组成分析、开放阅读框预测、蛋白质理化性质、二级结构预测分析、蛋白跨膜结构的存在与否、蛋白信号肽存在与否以及蛋白质三级结构预测分析。利用NCBI网站获得TSV基因序列(JX094350.1)。该基因长10128bp，经生物信息学分析知，TSV拥有编码氨基酸3286个，理论等电点(pl)为5.14，理论分子质量为366443.00u，不稳定系数(Ⅱ)为37.76，属于稳定蛋白质;完整基因序列中包含2个开放阅读框(Open reading frame，ORF);蛋白中存在跨膜结构;没有蛋白信号肽。以上对TSV的生物信息学分析有助于在分子水平上了解桃拉病毒的基因结构以及预测其感染机制，为预防病毒感染和病毒检测提供有用的信息。
　　(2)环介导等温扩增联合横向流动试纸条(LAMP-LFD)检测桃拉病毒桃拉病毒是威胁虾类养殖业的主要病毒之一。因此，本文建立了一种快速检测TSV的环介导等温扩增联合横向流动试纸条(LAMP-LFD)方法。基于TSV的衣壳蛋白VP2核酸序列，设计3对特异性引物(外引物:FIP/BIP，内引物:F3/B3，环引物:LF/LB)，进行LAMP反应体系的优化。其中引物LF以BIO标记，LB以FAM标记，用于横向流动试纸条(LFD)的检测。实验表明:LAMP最佳反应可在63℃恒温条件下40min内完成。整个扩增反应到LFD结果判定可在45min内完成。LAMP-LFD可特异性检出TSV特异性片段，未与其它病毒和细菌发生交叉反应，且其检测限为22.9fg。在样品检测反应时间上要比荧光定量PCR快1h左右，且LAMP-LFD方法操作简单，不依赖于仪器设备。具有很高的特异性，可满足TSV基层快速检测的需要。
　　(3)免疫磁珠富集与荧光定量PCR联合检测水中的嗜水气单胞菌。嗜水气单胞菌是多种水产动物的主要致病菌，可引发败血症。本研究建立了一种快速检测嗜水气单胞菌的荧光定量PCR方法。利用免疫磁珠对目标菌进行富集和捕获。针对嗜水气单胞菌的16SrDNA的序列设计特异性引物及TaqMan探针，优化荧光定量PCR反应条件，并结合常规PCR方法临床样品进行检测和验证。结合免疫磁珠分离技术使荧光定量PCR总体灵敏度、特异性增强。
　　综上所述，本研究对桃拉病毒的完整基因组进行生物信息学分析，并成功建立了适合基层检测的桃拉病毒LAMP-LFD体系。另外，结合免疫磁珠富集术建立了一种检测嗜水气单胞菌的荧光定量PCR方法。本研究对水环境中两种典型致病微生物的深度认识以及其核酸检测方法的建立对我国水产养殖环境的病害防控具有重要意义。