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随着人们生活水平的提高和食品安全意识的增强,使用益生菌来生产畜禽用口服疫苗倍受人们关注。其中,乳酸菌是公认的安全级(Generally Recognized As Safe,GRAS)益生菌,具有天然抗菌、抗病毒和抗肿瘤的作用,用它作为口服疫苗生产的载体不仅安全,且具有益生作用,能提高动物健康水平,促进动物生长,改善饲料报酬,降低生产成本。FaeG是产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)K88菌毛的主要粘附亚基,是导致断奶仔猪腹泻(Post-weaning diarrhea,PWD)的重要因素。本试验以乳酸乳球菌NZ9000为宿主菌,以pNZ8112为表达载体,以faeG为抗原基因,以化脓链球菌M6蛋白的最后140个氨基酸为细胞壁锚定序列(CWAM6),进行基因工程菌创制。将faeG和cwaM6通过柔性肽连接,然后转入NZ9000,通过nisin诱导,使faeG在NZ9000的细胞壁表面表达,为开发预防PWD的口服益生菌疫苗做前期探索。
1.参照GenBank上登录的K88ac的faeG基因保守序列设计一对PCR引物,上游引物引入SphI酶切位点,下游引物引入SpeI酶切位点和柔性肽(G-G-S-G-S)序列。将PCR产物克隆到pMD18-T载体上,测序结果显示该序列813 bp,包含相应的酶切位点和柔性肽序列。与Genbank中的faeG序列比对,该序列437位的a突变为t,相应的氨基酸由Glu变为Val,683位的g变为c,该突变是一个无义突变,整个序列的读码框没有改变,表明本实验克隆到了faeG基因。从碱基和氨基酸同源性比较看,相同血清型中的2个faeGab的同源性达99.6％,faeGac的同源性为55.9％-100％;不同血清型相比较,faeGab与faeGad的同源性为95.2％-95.6％,faeGab与faeGac的同源性为54.9％-70.5％,faeGad与faeGac的同源性54.9％-69.5％。Bioedit软件疏水分析表明该蛋白亲水和疏水部分比例相近。抗原性分析表明抗原表位所占比列约为50％,主要分布在相应的疏水区域。
2.根据Genbank上登录的化脓链球菌M6蛋白末端140个氨基酸碱基序列设计一对PCR引物,在上游引物引入SpeⅠ酶切位点和柔性肽序列(G-G-S-G-S)碱基,在下游引物引入HindⅢ酶切位点。测序结果显示PCR产物为457bp,在Genbank中进行序列对比,该序列第33位的a突变为g,此处为设计引物时引入的一个无义突变,突变掉模板上该处的一个HindⅢ酶切位点。氨基酸序列与原始序列相同,且在106-110位有细胞壁锚定分拣信号LPSTG,表明本实验克隆到了M6蛋白的细胞壁锚定序列(cwaM6)。二级结构分析显示该氨基酸序列中a-螺旋占60.7％,为主要二级结构域。电荷分布预测显示这段氨基酸序列带有大量电荷,前114个氨基酸呈现正负电荷交替分布,后面一段主要是正电荷。疏水性分析显示该序列主要由亲水氨基酸残基组成,只有115-134位为疏水残基。
3.通过酶切连接的方法来分级构建faeG细胞壁锚定表达质粒。首先将pMD18-T-faeG和pNZ8112用SphⅠ和SpaⅠ双酶切,然后用T4连接酶连接构建出pNZS112-faeG,测序结果显示该重组质粒的序列与预期相符,开放读码框正确。再把pMD18-T-cwaM6和pNZ8112-faeG用SpeⅠ和HindⅢ双酶切,T4连接酶连接构建出pNZ8112-faeG-cwaM6。测序结果显示pNZ8112-faeG-cwaM6序列和开放读码框正确。
4.将pNZ8112-faeG-cwaM6电转入乳酸乳球菌NZ9000,经nisin诱导后,SDS-PAGE凝胶电泳没有检测到目的蛋白。提取经过诱导的NZ9000的mRNA进行反转录,并经PCR扩增后检测到faeG-cwaM6条带,说明融合基因已经进行了转录。将pNZ8112-faeG电转入乳酸乳球菌NZ9000,经nisin诱导后,SDS-PAGE凝胶电泳检测到了FaeG蛋白。
本研究成功获得了faeG和cwaM6基因,构建了pNZ8112-faeG和pNZS8112-faeG-cwaM6表达载体,并检测到faeG进行了表达,faeG-cwaM6进行了转录。