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肌肉生长抑制素(Myostatin，MSTN)又称生长分化因子-8(growthdifferentiation factor8，GDF-8)，是一类重要的骨骼肌细胞生长发育的负调控因子，研究表明，该基因的缺失、突变能加速肌肉生长和改变红白肌的组成比例并增加肌肉量。CRISPR-Cas系统是一种来源于细菌获得性免疫的由RNA指导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术。本研究利用CRISPR-Cas9系统对阿尔巴斯白绒山羊胎儿成纤维细胞和肌肉卫星细胞中的MSTN基因进行了敲除，并通过实时定量PCR与Western blot检测了MSTN基因敲除后成纤维细胞中与之相关基因的表达情况，为通过CRISPR-Cas9系统生产基因编辑动物奠定基础。 1、gRNA表达载体的设计、构建与转染效率分析 本实验通过麻省理工学院的CRISPR Design（http://crispr.Mit.edu）软件设计4对长20nt的gRNA，以gRNA-T2为模板进行PCR，扩增得到完整的gRNA（最终PCR产物长度为455bp）。 为了筛选适应于山羊细胞的最优转染条件，本研究利用电穿孔法将红色荧光蛋白表达载体pCMV-DsRed导入绒山羊胎儿成纤维细胞中，通过流式细胞仪进行分析的结果表明，最优转染条件为:每1×106个绒山羊胎儿成纤维细胞加入pCMV-DsRed质粒10μg(1μg/μL)，Opti-MEM90μL，电压225V，脉冲时间2.5ms。 利用以上最佳转染条件将hCas9载体和gRNA共同导入阿尔巴斯绒山羊胎儿成纤维细胞中，培养48h后提取基因组，设计跨打靶位点的PCR引物进行PCR扩增，使用Surveyor突变检测试剂盒进行检测，确定有3个gRNA敲除效率较高，可以进行下一步实验。 2、利用CRISPR-Cas9技术制备MSTN基因敲除绒山羊胎儿成纤维细胞和肌肉卫星细胞的的制备与分析 采用最适合的转染条件，将hCas9载体和gRNA导入阿尔巴斯绒山羊胎儿成纤维细胞中和肌肉卫星细胞中，随机挑取单个细胞培养，建立单克隆细胞系。对每个单克隆细胞系的基因组进行PCR扩增并进行测序，筛选出靶位点发生突变的单克隆细胞系。本研究共获得62个胎儿成纤维单克隆细胞系，其中有10个单等位基因敲除的单克隆细胞系和10个双等位基因敲除的单克隆细胞系，总敲除效率为32.25％。还获得了6个肌肉卫星单克隆细胞系，其中有5个双等位基因敲除的阳性单克隆细胞系，总敲除效率为83.33％。 本研究选取了双等位基因敲除的阳性成纤维细胞细胞系C205，通过qPCR对MSTN基因敲除后的肌发育相关基因表达水平进行检测，发现该细胞中MSTN基因mRNA表达量下降73.79％，Western blot的检测结果也证实MSTN双等位基因敲除细胞中MSTN蛋白的表达比野生型细胞MSTN蛋白的表达量减少。而随着MSTN的表达的降低，MyoG、Myf5和Myf6等基因转录水平都有不同程度的上升，分别为对照细胞的1.53倍、5.68倍和3.683倍，说明MSTN对这三个基因起着负调控作用。