脑出血(Intracerebral hemorrhage,ICH)指血管破裂导致血液在脑实质内的聚集,是最严重的脑卒中亚型。人群中ICH的发病率为12-15/10万人每年,占所有脑卒中类型的10~15%,急性期病死率为30%~40%,90%以上患者遗留不同程度的神经功能障碍。随着医疗水平的逐渐提高,ICH患者的病死率呈下降趋势,但致残率仍居高不下,而且目前临床仍缺乏治疗ICH后神经功能障碍的有效策略,高致残率仍然是ICH治疗的瓶颈。因此,如何改善ICH患者的神经功能(如运动、感觉、认知等)障碍、降低ICH患者的残疾率成为ICH研究领域的重点。高血压性ICH好发于基底节区域,此区域含有大量的下行白质纤维传导束,损伤后往往导致严重的运动功能障碍。很多临床研究用弥散张量成像(diffusion tensor imaging,DTI)和弥散加权成像(diffusion-weighted imaging,DWI)来观察ICH后白质纤维束-皮质脊髓束(corticospinal trac,CST)的损伤,发现ICH后CST损伤的程度和运动功能障碍的程度密切相关。结果提示,在ICH早期减轻CST损伤有利于运动功能恢复。加之中枢神经系统神经再生困难,因此,在ICH早期保护更多神经纤维比促进后期神经再生更加关键,残存的神经纤维也是神经功能康复的结构基础。然而,我们回顾了既往ICH的主要研究方向,发现绝大多数研究聚焦在ICH后血脑屏障保护、灰质区神经元保护、炎症抑制、铁螯合、血肿吸收等机制和转化研究。值得注意的是,既往有1000多种在实验性脑卒中动物模型上证实有保护效果的药物,而且近200种药物进行了临床试验,但所有药物在临床试验中均没有显著性治疗效果。造成这种现象的原因有很多:第一,啮齿类动物与人类有巨大差异;第二,绝大多数研究忽略了非常重要的早期运动神经传导通路的保护;第三,随着研究的不断深入,我们会发现神经损伤的机制有很多,单一的干预措施只能取得适度的效果,只有把几种干预措施联合应用,才可能取得显著的效果。综上,ICH位置特殊性和多种损伤机制提示我们应该探索新的研究方向、干预靶点和模式动物来改善脑出血后神经功能障碍。因此,我们认为ICH的基础研究要注重以下几个方面:1)注重ICH早期运动神经传导通路-白质纤维束的保护,为功能恢复保留结构基础;2)利用与人类神经系统解剖结构相似的大动物进行实验,如非人灵长类动物、猪等;3)针对多种干预靶点、采用多种措施进行联合治疗。然而,关于ICH早期运动神经传导通路损伤的作用和机制研究仍为空白,在论文的第二章和第三章我们探索了两种关键的运动神经传导通路在ICH后的病理改变:控制精细运动的锥体系-CST和协调精细运动的锥体外系-黑质纹状体通路(Nigrostriatal pathway,NSP)近年来研究发现微管解聚和线粒体功能障碍参与了脊髓损伤、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)、帕金森病(Parkinson’s disease,PD)等疾病的发生发展。维持微管的稳定性可以促进啮齿类动物脊髓损伤后轴突再生、改善AD和PD症状;新近研究也发现,脊髓损伤后保护线粒体功能可以促进小鼠神经再生、改善运动功能障碍。Acetylatedα-tubulin是稳定型微管的标志物,促进acetylatedα-tubulin表达可以维持微管的稳定;抑制线粒体通透性转换孔(Mitochondrial Permeability Transition Pore,m PTP)开放可以缓解线粒体肿胀、改善线粒体的功能。我们推测促进acetylatedα-tubulin表达以维持微管的稳定和线粒体保护将有利于改善ICH后运动神经传导通路的损伤,并在论文的第二章和第三章探索了维持微管稳定性和线粒体保护对CST和NSP通路的保护作用。此外,稳定的、可重复的大动物脑出血模型非常必要,也可以用来探索临床前药物干预的剂量、周期、时机等。此外,在建立大动物脑出血模型后,应该建立相应的检测额评估脑出血严重程度的手段,特别是MRI对模型脑水肿、铁含量和白质纤维成像的分析。在本论文的第四章,我们重点探索了巴马香猪脑出血模型的建立,并利用MRI-T2、定量磁化率成像(quantitative susceptibility mapping,QSM)、弥散张量成像(diffusion tensor imaging,DTI)对脑组织结构、脑铁含量、白质纤维束进行无创、准确、定量的分析,为更多临床转化研究提供更符合临床的脑出血模型,而后探索了具有脑出血治疗前景的药物米诺环素(minocycline,Mino)在巴马香猪脑出血模型中的保护作用。具体研究内容如下:一、微管稳定和线粒体保护在小鼠脑出血后皮质脊髓束损伤中的作用与机制研究目的 脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)好发于白质纤维束密集的丘脑基底节区域,皮质脊髓束(Corticospinal tract,CST)是白质纤维束的轴突部分,作为控制精细功能的最重要结构,ICH后CST损伤的病理改变仍不清楚,本部分主要研究小鼠ICH后CST轴突的病理变化。探索微管和线粒体在ICH后CST轴突损伤的作用和机制,以及利用转基因小鼠、药物等技术增加稳定型微管acetylatedα-tubulin表达、保护线粒体功能能否改善小鼠ICH后CST轴突损伤和运动功能障碍,以及为脑出血后CST运动神经传导束的保护提供理论依据和可能的治疗策略。方法 利用Thy1-YFP小鼠,采用自体血25μL立体定位注入小鼠右侧纹状体区域构建ICH模型,首先利用免疫荧光、电镜等方式观察ICH后24h时血肿周围CST损伤的特点。然后利用MEC17-/-小鼠减少acetylatedα-tubulin表达使微管处于不稳定状态,HDAC6的特异性抑制剂Tubastatin A(Tub A)来增加acetylatedα-tubulin表达以增加微管稳定性,Cyp D的抑制剂环孢菌素A(cyclosporin A,Cs A)阻断m PTP形成、缓解线粒体肿胀等方式单独或者联合应用到ICH小鼠上,并采用免疫荧光染色、电镜、神经环路示踪等方法评估CST运动神经传导束的形态学变化,利用Beam-walking,irregular ladder walk等行为学方法检测精细运动功能改变,评估稳定微管及线粒体保护的作用。此外,提取原代皮层神经元,观察神经元突起内线粒体的运动以及acetylatedα-tubulin和线粒体的位置关系。结果1.小鼠ICH导致CST轴突的退缩样小球的病理改变,电镜结果发现退缩小球内含有无规则排列的微管和肿胀的线粒体,形成无营养神经锥。顺行神经环路示踪提示CST的损害,行为学发现CST相关精细运动功能障碍。2.小鼠ICH后24小时内白质纤维的损伤仅发生在轴突内,髓鞘没有显著损伤,ICH后第7天髓鞘崩解最为严重,ICH后第14天有新形成髓鞘的出现。3.小鼠原代皮层神经元突起上41%线粒体与acetylatedα-tubulin表达的“增强点”共标,敲除MEC17导致acetylatedα-tubulin表达缺失引起运动的线粒体数目显著减少。4.MEC17敲除小鼠的ICH模型表现出更加严重的CST轴突损伤和运动功能障碍。5.利用Tub A增加acetylatedα-tubulin表达、Cs A缓解线粒体肿胀均能够减轻ICH导致的CST损伤,如减少退缩小球的形成、改善运动功能障碍,两者联合干预ICH小鼠能够取得更加显著的保护效果。结论该部分研究探索了小鼠ICH导致的锥体系-CST运动神经传导束的病理损伤以及机制,我们发现了ICH后早期微管解聚和线粒体损伤是CST运动神经传导束损伤重要原因,acetylatedα-tubulin和线粒体相辅相成,同时促进acetylatedα-tubulin表达和保护线粒体功能显著改善ICH后CST损伤,并认为联合多种治疗措施在ICH早期进行运动神经传导通路保护是治疗运动障碍的关键,为ICH后运动功能障碍治疗提供了新的研究策略和干预靶点。二、微管稳定在脑出血后小鼠黑质纹状体通路损伤中的保护作用与机制研究目的黑质纹状体通路(Nigrostriatal pathway,NSP)是锥体外系主要神经结构之一,由起源于黑质、投射到纹状体的多巴胺能神经元胞体及纤维构成,主要作用是调节肌肉张力、协调各种精细复杂的运动。纹状体内含有尾状核、豆状核以及大量从中间穿行的白质纤维束,是脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)好发部分。目前仍没有对纹状体出血后NSP通路损伤的系统性研究及干预。因此,本部分关注于小鼠ICH对NSP通路的损伤,以及探索Acetylatedα-tubulin介导微管稳定在ICH后NSP损伤中的保护作用与机制,为ICH后精细运功功能障碍的恢复开拓新的研究思路。方法本实验采用自体血25μL立体定位注入小鼠右侧纹状体区域构建小鼠ICH模型。在建模成功后的1、3、7天分别用免疫荧光染色、电镜、Western-blot、神经环路示踪等技术检测出血周围纹状体及同侧黑质区多巴胺能神经元纤维和胞体的病理改变,并检测转运多巴胺的囊泡单胺转运体2(vesicular monoamine transporter-2,VMAT2)、囊泡运输蛋白(Kinesin和Dynein)表达水平以及多巴胺神经递质含量来检测多巴胺能神经元功能。此外,我们利用评估大体运动功能的行为学(旷场、神经功能评分、Rotarod)和精细的行为学(Beam walking和irregular ladder walk task)检测ICH后小鼠的运动功能障碍,以及检测稳定型微管acetylatedα-tubulin的蛋白表达水平与上述多巴胺能神经元形态和功能异常的相关性。同时,我们给予微管稳定剂Epo B来干预小鼠ICH模型、体外氧合血红蛋白模拟的ICH模型,观察其对NSP中多巴胺能神经元及纤维损伤的保护作用及对精细运动行为学的修复作用。此外,利用上述实验方法,我们将微管解聚剂Nocodazole注射到纹状体内观察单独微管解聚因素对NSP的损伤效应和Epo B的反转效应。最后,我们利用慢病毒、腺病毒载体将αTAT1/MEC17(α-tubulin的乙酰基转移酶)sh RNA在体及离体干预黑质区的多巴胺能神经元来降低acetylatedα-tubulin表达,观察单纯的稳定型微管acetylatedα-tubulin降低对黑质神经元胞体、纤维以及相关行为学的影响。结果1.小鼠纹状体出血导致血肿周围多巴胺能神经元纤维密度、同侧黑质区多巴胺能够神经元数目均显著降低。多巴胺能神经元呈现“空泡状”病理改变,伴随多巴胺神经递质囊泡转运相关蛋白VMAT2、Kinesin、Dynein表达降低、多巴胺神经递质含量降低、稳定型微管标记物acetylatedα-tubulin表达显著降低。2.顺行、逆行神经环路示踪均显示小鼠纹状体出血导致黑NSP通路的显著损害,旷场、神经功能评分方法只能发现3天内ICH小鼠的运动功能障碍,但需要技巧性的精细运动(Beam waking和irregular ladder walk task)在ICH后14天仍有功能障碍。3.微管稳定剂Epo B干预可以增加稳定型微管acetylatedα-tubulin表达,改善上述脑出血导致的NSP结构和功能的损害,并显著提高ICH后精细运动功能。4.微管解聚剂Nocodazole注射到纹状体内可以引起上述ICH后NSP的损伤及运动功能障碍,提示单独微管解聚因素对NSP既有损伤效应,维持微管稳定性是保护ICH后NSP损伤是重要靶点。5.αTAT1 sh RNA干预均可以降低多巴胺能神经元稳定型微管acetylatedα-tubulin表达下调,加重ICH及氧合血红蛋白对NSP结构和功能损伤,Epo B对αTAT1 sh RNA及氧合血红蛋白干预引起的多巴胺能神经元损伤也有显著的保护作用。结论小鼠纹状体出血会导致NSP通路的损害,ICH后acetylatedα-tubulin表达降低导致微管稳定性下降可能是NSP运动通路损伤的重要原因。微管稳定剂Epo B的干预可以增加acetylatedα-tubulin表达、显著减轻ICH导致的NSP通路损害,改善了ICH小鼠运动功能障碍。该部分研究首次探索了ICH导致的锥体外系-黑质纹状体通路的损害以及可能的机制,为改善ICH后运动功能障碍提供了新的思路。三、巴马香猪脑出血模型的建立及大动物MRI检测方法的探索目的实验性脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)模型主要建立在啮齿类动物中,但啮齿类动物白质纤维组织不够丰富,也无明显的内囊解剖结构。因此,本实验我们拟建立稳定性好、可重复、便于操作的巴马香猪ICH模型,同时对出血后脑水肿、脑室体积改变、铁沉积等进行多时间点的观察分析,并采用MRI-T2、QSM、DTI等序列进行脑组织结构分析、铁含量定量分析和白质纤维束定量分析,并观察米诺环素干预猪ICH模型的治疗效应,以此来评估模型的稳定性和可靠性,为更多临床转化研究提供更符合临床的ICH模型。方法我们选取10-12Kg的雄性巴马香猪,异氟烷麻醉后将猪固定到大动物立体定位仪上,在内囊上方(坐标为:前囟前11mm;旁开11mm)的颅骨表面钻一个直径约1mm大小的孔,利用微量注射泵、5m L注射器和33G针头将2m L自体动脉血缓慢注射到猪的右侧内囊区域,深度18mm。在脑出血后1天、7天、28天对巴马香猪进行MRI-T2、QSM、DTI扫描、脑含水量测定、血肿周围铁含量测定以及免疫组织化学染色。此外,我们在巴马香猪ICH模型中检测米诺环素的保护效应。结果1.自体血注入巴马香猪内囊处,造成了脑内血肿、脑室扩张、脑水肿、白质纤维损伤及神经功能障碍,较好的模拟了ICH的临床特点,表明巴马香猪ICH模型是一个具有相似性、重复性、可靠性的模型;2.血肿周围铁含量测定和QSM定量磁化率数值相关性好,QSM可以对脑出血后血肿周围铁含量进行无创的、准确的定量分析。DTI可以对白质纤维束进行定量分析;3.米诺环素可以行使铁螯合功能,降低血肿周围铁含量的同时,改善了巴马香猪脑水肿、侧脑室扩张、白质纤维束损伤及神经功能障碍。结论巴马香猪ICH模型具有相似性、重复性、可靠性;QSM是一种可以无创的、准确的评估ICH后急性、慢性期血肿铁含量的方法;米诺环素可以减轻巴马香猪ICH模型引起的脑水肿、脑室扩张、铁超载、白质纤维损伤、胶质细胞激活、神经功能障碍等。