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前期的研究结果显示,Serratia sp.FS14可以分泌一种具有V字形耐高温特性的蛋白酶。沙雷氏菌可以分泌多种胞外蛋白酶,Serralysin是其中的一种非常重要的蛋白酶。为了明确FS14中具有V字形耐高温特性的蛋白酶的来源,本研究首先利用同源重组的方法构建了 FS14△serralysin无痕缺失突变株。研究显示,该突变株的培养上清液仍然具有V字形的耐高温蛋白酶活性,因此这种特殊的蛋白酶可能不是serralysin。我们随后从突变株FS14Aserralysin的培养液中分离纯化得到一个大小约为50 kDa的蛋白,酶学特性研究显示,该蛋白是一种最适反应温度为37 ℃,最适反应pH值为8.0的具有V字形耐高温特性的碱性蛋白酶,该蛋白酶在4到50 ℃预处理10 min后,具有较强的蛋白酶活性,60℃预处理后,蛋白酶活性显著下降至4%,而在70到90℃处理后,蛋白酶活性明显高于60℃且呈上升趋势,90℃处理10 min后还具有40%的蛋白酶活性。我们将这个具有V字形耐高温特性的蛋白酶进行了质谱鉴定,并将鉴定结果与FS14的全基因组序列进行了对比分析,结果显示,这个具有V字形耐高温特性的蛋白酶属于Serralysin家族,我们将其命名为Serralysin-like protease B,即SPB蛋白。为了进一步证明V字形耐高温特性来源于SPB蛋白酶,我们构建了FS14AserralysinASPB突变株,结果显示该突变株的培养上清液几乎不具有蛋白酶活性;我们随后将带有SPB自身启动子和C-端带有his-tag编码基因的SPB基因在FS14AserralysinASPB突变株中进行了表达,并对重组SPB蛋白进行分离纯化,酶学特性研究结果显示,重组SPB的酶学特性与从FS14Aserralysin突变株中分离纯化的野生型SPB的酶学特性相似;此外,我们还用同样的方法表达及纯化了 SPB的突变体蛋白E176A,结果显示E176A突变体不具有蛋白酶活性,这说明E176是SPB蛋白酶催化所必需的氨基酸残基。这些结果均证实了 FS14中的SPB蛋白是一种具有V字形耐高温特性的蛋白酶。为了明确SPB蛋白酶的V字形耐高温机制,我们比较分析了经EDTA处理和不经EDTA处理的SPB蛋白在不同温度(4-90℃)下热处理后的蛋白残留量,结果显示,不同温度处理后但不经EDTA预处理的SPB蛋白的残留量与蛋白酶的活性强弱相关,也呈现出特殊的V字形;而经EDTA预处理后又作不同温度处理的SPB蛋白的残留量几乎保持一致。因此,我们推测SPB蛋白酶的V字形耐高温机制可能是SPB蛋白的自水解特性导致的,SPB在60℃自水解活性最强,残留量最低,蛋白酶活性最低;但随着温度的升高,SPB蛋白酶的热变性导致SPB蛋白酶的自水解活性减弱,因此蛋白的残留量增加,蛋白酶活性增高。为了明确SPB蛋白酶耐高温特性的结构基础,我们从FS14△serralysin的上清液中分离纯化了 SPB蛋白,对其进行结晶条件的筛选,在0.1 M Tris,pH 8.0;28%PEG4000的条件下筛选得到了蛋白晶体,最好的晶体可以衍射到2.3 A。我们以FS14中Serralysin为模板,通过分子置换法解析了 SPB的三维结构。结果表明,该蛋白的整体结构与Serralysin蛋白家族的结构较相似,但也存在很大的差异性,这些结构上的差异性可能是SPB蛋白酶具有V字形耐高温特性的原因。