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产志贺毒素大肠埃希菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC)是一类重要的食源性致病菌,人感染后可引起轻度腹泻、出血性肠炎(hemorrhagic colitis,HC)甚至病死率高的溶血性尿毒综合征(hemolytic uremic syndrome,HUS)。牛羊等反刍动物是STEC主要宿主,人主要经粪-口途径感染。目前已报道的STEC血清型达470多种,其中O157:H7是致病性最强也是最常见的血清型,但近年来由非O157 STEC引起的散发感染和暴发的报道越来越多,由其引发的病例在某些国家超过了 STEC O157:H7。志贺毒素(Shiga toxin,Stx)是STEC最重要的毒力因子,可分为志贺毒素1(Shiga toxin 1,Stx1)和志贺毒素2(Shiga toxin 2,Stx2)两种型别。迄今为止已报道STEC中存在3种Stx1亚型和9种Stx2亚型,不同亚型或亚型组合在宿主特异性及致病性等方面存在差异。目前对Stx1/Stx2亚型的鉴定主要通过基于stx1/stx2基因序列差异建立的亚型特异性PCR方法。我们前期对STEC菌株进行亚型分析时,发现1株stx2阳性菌株STEC388不能用现有PCR方法进行分型。将其与目前已知的不同Stx2亚型的氨基酸代表序列构建系统发生树,结果显示STEC388为一个单独分支,即此菌株携带一种新的Stx2亚型,将其命名为Stx2k。Stx2k与Stx2a-Stx2i的核苷酸序列相似性为62.5%～96.3%,氨基酸序列相似性为72.7%～97.0%。根据stx2k基因特定差异位点,设计了 Stx2k的PCR分型检测引物,对实验室自2009年4月到2017年11月间收集和分离的787株非O157 STEC进行了 Stx2k筛查,发现了另外8株Stx2k-STEC菌株,对这些菌株进行分子特征分析。9株Stx2k-STEC菌株经丝裂霉素C诱导后,对Vero细胞的毒性存在较大差异,但总体上均低于STEC O157:H7暴发菌株Xuzhou21。全基因组测序显示9株STEC菌株基因组大小为4,857,389 bp～5,326,462 bp,可分为 7 种血清型(O8:H19、O48:H21、O100:H19、O159:H16、ONT:H30、022:H8 和 O93:H28),7 种 MLST 型 ST162、ST155、ST1611、ST3630、ST993、ST446和ST403)。Stx由前噬菌体编码,Stx2k前噬菌体存在4种不同的染色体插入位点:dus、yccA、zur及Ser-tRNA。全基因进化分析显示,Stx2k-STEC菌株与STEC、ETEC及STEC/ETEC杂合型菌株具有较近亲缘关系,提示Stx2k噬菌体具有整合到不同遗传背景大肠埃希菌中的能力。仅志贺毒素并不能引起严重疾病,位于LEE毒力岛上的eae基因(E.coli attaching and effacing)编码的紧密粘附素(intimin)也在STEC O157:H7的致病性中也发挥重要作用,而非O157 STEC携带eae基因的研究较少。本研究对eae在非O157 STEC菌株中的分布情况及序列多态性进行了分析。735株非O157 STEC菌株中共有70株(9.5%)eae基因阳性菌株,分别分离自不同动物(43株)、腹泻患者(9株)及食品(4株),其余14株来源不详。通过PCR扩增测序得到了 62条eae基因全长序列,根据序列相似性分为18种不同的基因型,核苷酸序列相似性从86.01%到99.97%不等,其中7种基因型为本研究首次报道。通过对已报道的30种不同eae基因亚型参考序列与本研究获得的18条特异序列构建Neibour-Joining系统发生树,本研究的eae基因可分为5种亚型,即β1、γ1、ε1、ξ3和θ。研究发现eae亚型/基因型与血清型及菌株来源有一定相关性。血清型为O26:H11、O103:H2及O111:H8的菌株与特定的eae亚型相关,分别对应ε1、β1和θ。大部分腹泻患者来源的STEC(7/9,77.8%)携带 eae-β1 亚型,而大部分牛来源的 STEC(23/26,88.5%)携带 eae-ζ3亚型。综上所述,本研究发现和命名了一种新的Stx2k亚型,丰富了 Stx2亚型,进一步强调了 STEC菌株基因组的可塑性,并分析了中国不同来源的非O157 STEC菌株中eae基因的遗传多样性。