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刚地弓形虫( Toxoplasma gondii)是一种单细胞原虫,能侵犯包括人类在内的几乎所有温血动物有核细胞,其感染所致的弓形虫病是世界范围的严重机会致病性寄生虫病。我国弓形虫血清阳性率约为7.88%,但是随着人们饮食习惯及行为方式的改变,弓形虫感染率在我国正呈上升的趋势,其感染所带来的危害正受到越来越多人的关注。弓形虫感染也是引起家畜(例如家猪)死亡的常见病因之一,从而导致养殖业减产。因此本病是常见的人兽共患寄生虫病。目前对于弓形虫病的治疗仍以磺胺嘧啶(Sulfadiazine,SDZ)和乙胺嘧啶(Pyrimethamine)的联合使用作为首要选择。但这种治疗方式存在明显的局限性,因为磺胺类药物只能抑制增值状态的速殖子,而对相对静止和潜伏状态的包囊和缓殖子效果较差。该类药物还存在一系列毒副反应。因此寻求新的药物治疗靶标及新的治疗手段仍是弓形虫病防治的当务之急。弓形虫不能进行嘌呤核苷酸的从头合成,依赖两条补救途径合成嘌呤核苷酸,参与的酶分别是腺苷激酶(AK)和次黄嘌呤-黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HXGPRT)。弓形虫嘌呤代谢的特点使得这两个关键酶成为备受关注的药物治疗靶点。RNA干扰是近年兴起的一项快速、简便、高效地抑制基因表达的新技术,已成为基因功能研究、基因治疗和寻找药物靶点的重要工具。该技术已从线虫的研究拓展到各种生物。然而,遗憾的是,弓形虫作为顶复门重要的模式生物,相关研究却鲜有报道。对于低等生物,RNA干扰始于长片段dsRNA的降解,直接转染长片段dsRNA就可以特异抑制目的基因的表达。而对于哺乳动物细胞,通常采取的策略是直接转染小干扰RNA分子(siRNA)以避免长片段dsRNA在细胞内诱发的非特异性基因抑制。这两种分子(长片段dsRNA及siRNA)是否能在弓形虫体内抑制目的基因的表达?运用这两种基因表达调节工具双通道抑制弓形虫嘌呤代谢途径中两个关键酶后是否能有效抑制弓形虫的增殖?上述问题是本研究拟解决的关键问题。本研究以嘌呤补救合成途径中的关键酶——AK和HXGPRT编码基因为靶标,采用体外转录长片断dsRNA及化学合成siRNA两种不同的分子分别转染弓形虫速殖子。根据基因转录表达结果,阐明长片断dsRNA及siRNA对弓形虫体内基因表达的影响。在此基础上,双通道下调弓形虫嘌呤代谢途径中这两个关键酶,观察对虫体增殖的抑制情况及其在小鼠体内的毒力改变情况,进一步探讨在弓形虫感染中其作为治疗工具的可能性,为开发新的抗弓形虫药物及新的治疗方法奠定基础。1.长片断dsRNA在弓形虫体内对目的基因的抑制在电转后24h,检测到4μg AK dsRNA转染弓形虫体内AK mRNA水平明显降低(P<0.05),相对表达值为0.34±0.13。而8μg及12μg AK dsRNA转染弓形虫体内AK mRNA的相对表达值分别为0.97±0.25,1.15±0.02,与模拟电转弓形虫相比差异没有显著性(P>0.05)。酶活性检测结果显示,4μg AK dsRNA转染弓形虫AK酶活性在转染后24h开始降低,但与模拟电转弓形虫相比差异没有显著性。在转染后48h,AK酶活性为模拟电转弓形虫的0.56±0.15倍(P<0.05)。其他两个剂量组没有检测到显著降低的AK酶活性。HXGPRT dsRNA电转后对HXGPRT mRNA水平影响的规律与AK dsRNA对相应mRNA的影响相似。转染后24h,4μg HXGPRT dsRNA转染弓形虫体内HXGPRT mRNA的相对表达值为0.33±0.16,与模拟电转弓形虫相比差异有显著性(P<0.05)。而8μg及12μg HXGPRT dsRNA转染弓形虫体内HXGPRT mRNA的相对表达值分别为0.80±0.19,0.90±0.27,与校准样本相比差异没有显著性。HXGPRT酶活性检测结果显示,在转染后48h,4μg HXGPRT dsRNA电转弓形虫[3H]–次黄嘌呤摄入量与模拟电转弓形虫相比明显降低(P<0.05),酶活性相对值为0.59±0.02。而8μg和12μg HXGPRT dsRNA电转弓形虫的HXGPRT酶活性没有发生明显降低(P>0.05)。LacZ dsRNA转染不能降低弓形虫体内AK与HXGPRT的mRNA水平及酶活性。2.长片断dsRNA双通道抑制AK及HXGPRT对弓形虫增殖速率的影响在感染宿主细胞后24h、30h及42h,AK及HXGPRT长片段dsRNA联合电转弓形虫的平均倍增次数分别为1.85±0.97,2.62±1.00,4.27±1.07,与模拟电转弓形虫组的平均倍增次数相比均明显减少(P<0.05)。这表明dsRNA联合干扰弓形虫后,其增殖速率明显放慢。在感染后24h,流式细胞术检测结果显示dsRNA联合电转弓形虫组的感染率为29%,而模拟电转弓形虫组的感染率为40%。3. siRNA在弓形虫体内对目的基因的抑制在针对AK编码基因设计的三对25nt的siRNA中,有两对(siRNA786,siRNA1200)能明显降低AK mRNA水平及酶活性,且抑制效率呈剂量依赖性。在感染后24h,2μM及4μM siRNA786电转染弓形虫体内的AK mRNA有明显降低(P<0.05),其相对值分别为0.59±0.08,0.47±0.13,而1μM siRNA786电转染弓形虫体内的AK mRNA与模拟电转弓形虫相比没有明显降低。4μM siRNA1200电转弓形虫体内的AK mRNA水平为模拟电转弓形虫的0.52±0.19倍(P<0.05)。AK酶活性检测结果显示,在感染后24h,2μM及4μM电转弓形虫的[3H]-腺苷摄入与模拟电转弓形虫组相比有明显降低(P<0.05),酶活性相对值分别为0.45±0.19,0.39±0.11。而4μM siRNA1200电转染弓形虫体内AK酶活性与模拟电转弓形虫相比也有明显降低(P<0.05)。在针对HXGPRT编码基因设计的三对21nt的siRNA中,只有一对(siRNA415)能明显降低HXGPRT mRNA水平及酶活性。在转染后24h,4μM siRNA415电转弓形虫的HXGPRT mRNA水平及[3H]–次黄嘌呤摄入量分别降为模拟电转弓形虫的0.36±0.04及0.51±0.03倍(P<0.05)。4. siRNA双通道抑制AK与HXGPRT对弓形虫增殖及感染能力的影响在感染宿主细胞后24h,4μM的siRNA786和siRNA415联合电转弓形虫、磺胺嘧啶处理弓形虫及模拟电转弓形虫的平均倍增次数分别为:1.64±0.95、1.04±0.88及2.32±0.90,前两组与后者相比倍增次数明显减少(P<0.05)。在感染后40h,siRNA联合电转弓形虫及磺胺嘧啶处理弓形虫的平均倍增次数分别为3.00±1.04,2.56±1.04,与模拟电转染组相比(3.60±0.80)差异有显著性(P<0.05)。为进一步探讨弓形虫AK及HXGPRT被同时抑制后在小鼠体内的毒力,将28只小鼠随机分成4组,每组7只。模拟电转组:模拟电转弓形虫感染小鼠; SDZ处理组:模拟电转弓形虫感染小鼠后连续7天SDZ灌胃(200mg/kg/d);siRNA处理组:小鼠感染siRNA786及siRNA415联合电转弓形虫;SDZ&siRNA联合干预组: siRNA786及siRNA415联合电转弓形虫感染小鼠后连续7天SDZ灌胃(200mg/kg/d)。结果表明,在20天的观察时间内,模拟电转组、SDZ处理组、siRNA处理组及SDZ&siRNA联合干预组小鼠的平均存活天数分别为:7.14±0.37,8.85±1.34, 8.14±1.34,10.83±4.67天,与前者相比,SDZ处理组及siRNA处理组小鼠的存活天数虽然有所延长但差异没有显著性,而SDZ&siRNA联合干预组小鼠的存活天数差异有显著性(P < 0.05)。综上所述,我们得出以下结论:(1)体外转录长链dsRNA在弓形虫体内能抑制目的基因的表达;(2)25nt及21nt的siRNA在弓形虫体内能特异性抑制目的基因的表达;(3)弓形虫嘌呤代谢途径中的关键酶——AK和HXGPRT被体外转录长链dsRNA或siRNA双通道抑制后,弓形虫在细胞内的增殖速率减缓;(4) siRNA双通道抑制嘌呤代谢途径再联用SDZ能明显延长感染小鼠的存活时间。