结直肠癌(colorectal carcinoma，CRC)发病率不断上升，我国原为结直肠癌低发区，但随着人们生活水平的提高以及生活方式的改变，发病率趋于高发。近年来治疗方法进展迅速，但晚期患者确诊时已发生转移高达37％，预后仍然较差，因此早期诊治至关重要。结肠镜是可靠的筛查与诊断手段，但其价格昂贵，且具有侵入性，早期无症状或症状轻微的患者往往难以接受肠镜检查。而癌胚抗原(carcino—embryonic antigen，CEA)、糖链抗原19-9(carbohydrate antigen19-9，CA199)等肿瘤标志物敏感性与特异性较差，不适于筛查与诊断。 随着生物标记物在分子水平上诊断肿瘤的发生发展，人类基因组计划的完成，高通量技术的出现，计算机生物学的异军突起，寻找有效的肿瘤生物标记物已成为肿瘤筛查和早期诊断的重要方法。肿瘤基因组学对生物标记物的发现已做出重要的贡献。 蛋白质组学，研究的是整个细胞或组织的全部蛋白，能替代基因组学检测临床样本。细胞分泌的蛋白质构成血清或尿液中的蛋白质谱，细胞性质功能改变，蛋白质谱随之变化。因此蛋白质组学分析能检测临床样本，这为临床早期高通量检测提供了一种有效的方法。 作为一种新的高通量筛选技术，蛋白质组学已迅速成为研究肿瘤标记物、肿瘤发病机制及靶向治疗位点的重要手段。肿瘤细胞产生并释放各种蛋白质分子至血液中，构成与正常人不同的蛋白质谱，包括了肿瘤发生发展的分子改变。蛋白质谱中的蛋白，甚至蛋白亚型的改变均可被检测，这使得发现结直肠癌敏感的肿瘤生物标记成为可能，促进分子诊断与治疗的发展。 目前公认多基因突变诱发结直肠粘膜出现腺瘤性息肉，进而转变为侵袭性肿瘤，最终发展为转移性癌肿，这是结直肠癌发生发展的典型过程。本研究应用双向电泳与基质辅助激光解吸附质谱技术，比较腺瘤早期恶变与腺瘤患者血清蛋白质的差异表达，初步筛选出血液中结直肠癌的早期诊断标志物。 研究目的： 1.应用2D—DIGE技术检测结直肠腺瘤及腺瘤早期恶变患者血清蛋白质斑点，初步筛选出两组的血清差异蛋白。 2.应用MALDI—TOF MS鉴定差异蛋白，筛选出可能作为CRC早期诊断血清肿瘤标志物，探讨CRC发病的可能机制。 研究方法： 1.临床资料及血清标本收集 选择来自中山大学胃肠研究所组织库中2007年5月至2008年5月的结直肠腺瘤及腺瘤早期恶变患者血清各8例，分别作为对照组和研究组，治疗前在清晨空腹抽取血，分离血清，分装。 2.胶内差异双向电泳(two dimensional—difference in gel electrophoresis，2D—DIGE)分析 提取血清总蛋白，经蛋白质纯化和定量后，进行2D—DIGE分离。2D—DIGE凝胶中预先被Cydye染料标记的蛋白质斑点，经多功能激光扫描仪不同波长的激光扫描后，获取荧光胶内差异蛋白表达图谱，使用DeCyder软件分析。比较腺瘤与腺瘤早期恶变患者血清中的蛋白质差异。 3.差异蛋白点的筛选和切取 将与2D—DIGE匹配的Deep purple荧光染色的制备胶装入全自动斑点处理工作站并固定，选取两组蛋白表达差异1.5倍以上的蛋白质斑点进行斑点处理，完成凝胶上相应斑点的切取、脱色、酶切和质谱靶点样。 4.蛋白质点鉴定 应用基质辅助激光解吸/电离—飞行时间质谱仪(Matrix assisted laser desorption/ ionization—time of flight mass spectrometry，MALDI—TOF MS)进行蛋白质的肽质量指纹谱(peptide mass fingerprint，PMF)鉴定。 5.质谱数据的检索 将PMF数据进行本地Profound检索和在线MASCOT检索。两种软件检索数据一致的认为是成功鉴定出的蛋白质。对质谱成功鉴定出的蛋白质，将凝胶图谱和质谱数据综合，筛选出差异蛋白质，构成腺瘤早期恶变血清蛋白质谱。 实验结果： 1.血清蛋白质浓度 两组血清蛋白质经过提取和纯化后，测定的浓度分别为28.29±2.39(μg/μl)和29.31±2.51(μg/μl)，无统计学差异(F=0.413，P>0.05)。 2.2D—DIGE的检测率 经DeCyder软件分析平均检测率为1732(±43.92)个斑点。而同步进行的三张Deep purple荧光染色制备胶也达到了近1700个斑点的检测率。 3.2D—DIGE凝胶图谱差异分析 运用DeCyder V6.0软件进行胶内分析，同时利用内标进行胶间分析，获得的凝胶间匹配率最低为82.7％，找出丰度差异大于1.5倍的蛋白质斑点35个，其中24个蛋白点表达显著上调，11个蛋白点表达显著下调。 4.质谱鉴定及数据库检索 经过MALDI—TOF—MS分析，获得35个差异蛋白点的肽质量指纹图谱PMF，其中30个PMF数据经本地Profound检索和在线Mascot检索获得到了一致的结果，将30个蛋白质的分子量和等电点与凝胶上相应斑点的分子量和等电点对比基本符合，可认为是成功鉴定的蛋白质，鉴定率达85.71％。其中23个蛋白点表达上调，7个蛋白点表达下调。多数蛋白点出现重复鉴定，但重复蛋白点相邻，且强度变化趋势一致，再次证明结果的可靠性。合并重复鉴定的蛋白，获得的差异蛋白17种，其中11种为上调蛋白，6种为下调蛋白。分析其结构和功能，可分为蛋白酶抑制剂、补体蛋白、免疫球蛋白、角质素、信号转导蛋白、未知功能蛋白六类。其中7种是首次发现，它们的功能与免疫、生长调节、信号转导调控等密切相关。 结论： 1.2D—DIGE结合MALDI—TOF—MS分析可成功分离鉴定结直肠腺瘤早期恶变与腺瘤患者血清差异蛋白。 2.与结直肠腺瘤患者对比，腺瘤早期恶变患者有多种血清蛋白质发生变化，其差异蛋白质可能成为诊断早期结直肠癌新的生物标志物，它们可能对结直肠癌的诊断、治疗以及预后均具有重要作用。