CTCF(CCCTC结合因子)是一种结构高度保守、功能多样的锌指蛋白，作为基因组高级结构和功能的主要组织者，在基因的活化、抑制、基因印迹、X-染色体失活、RNAi与ncRNA的转录等多种细胞生理过程中发挥重要作用。CTCF所具有的这些表观遗传上的功能在细胞类型的发育与分化、在雌性哺乳动物中介导X染色体失活保持X染色体剂量平衡中发挥重要的作用。CTCF具有十一个高度保守的锌指结构域，通过它们的不同组合，可以识别不同的DNA靶位点序列。研究显示，CTCF在人类全基因组的识别位点大约有3万个左右，表明CTCF在介导基因的表达以及基因组在核内的三维空间的组织构象上可能发挥十分重要的组织者的作用。　　 染色体构象俘获(chromosome conformation capture，3C)技术是近年来新出现的一种研究染色体高级构象、远距离染色质相互作用的有力工具，高通量的4C(circularchromosome conformation capture)技术以及其它3C相关技术的进一步发展，特别是与染色质免疫沉淀技术(Chromatin immunoprecipitation，ChIP)的结合，大大促进了人们对细胞核内复杂组织结构的认识，揭示核内广泛存在的、复杂精细的染色体内、染色体之间的相互作用网络。　　 为了研究CTCF在介导核内染色质空间组织中所发挥的作用。我们选取了两段序列保守、在不同细胞类型中均能够被CTCF结合的DNA片段作为4C的Bait，将它们分别命名为CT6(位于6号染色体上)和CT14(位于14号染色体上)。通过去除4C样品中线性DNA分子的方法，将4C的方法进行了改进，降低了4C反向PCR扩增的背景，大大提高了4C方法的筛选工作效率。通过有限克隆与筛选，得到了一些有意义的与这两个Bait发生相互作用的元件。　　 我们选取两组通过4C方法所筛选到的相互作用位点，进一步研究了CTCF在染色体内和染色体之间的相互作用中的可能作用：1)染色体之间的相互作用，CT14与ARH；2)染色体内的相互作用，kcnq5基因座位上的CT6与通过CT6所筛选到的DNA片段319、202、225(克隆号)。　　 通过针对CTCF和Rad21的ChIP发现，它们在这一对位于不同染色体上的位点CT14与ARH上共定位。通过3C的方法证明了它们之间的相互作用；并得到了3D-DNA FISH的进一步证明。通过ChIP-loop的方法进一步证明了，这种相互作用是这两种蛋白因子共同介导的。比较MCF-7以及Jurkat细胞中这一对位于不同染色体上的相互作用频率发现，这种相互作用模式在不同的细胞中具有细胞特异性。　　 在kcnq5基因座位内，4C方法筛选到了三个与保守的CT6相互作用的位点319、202、225，它们可能也是潜在的CTCF结合位点。为了全面的了解CTCF在介导kcnq5基因座位内的相互作用过程，我们选择了曾经在IMR90和U937细胞中报道的、在kcnq5基因座位内的四个可能的CTCF结合位点，与通过4C筛选到的这3个位点以及CT6一起，通过3C的方法进行了分析验证，揭示了kcnq5基因座位内局部的空间组织模式。　　 ChIP分析表明这些所考察的位点都能够被不同程度的富集，证明了这些位点在MCF-7细胞中可能被CTCF所结合。通过ChIP、ChIP-loop以及3C的方法证明了kcnq5基因座位上的这些位点间的相互作是通过CTCF介导的。通过相同的方法进一步证明了Rad21共同参与了这种kcnq5基因座位内的相互作用过程。抑制CTCF和Rad21两个基因，这些相互作用位点的作用频率明显下降。进一步验证了它们共同参与了kcnq5基因座位内的空间组织过程。将MCF-7和Jurkat细胞中的相互作用频率相比较，证明这种相互作用模式具有细胞特异性。　　 无论染色体间的、还是基因座位内的相互作用都可能对相关基因的功能产生重大影响。本文对这两种相互作用模式对相关基因的表达调控作了分析。在MCF-7细胞中分别抑制CTCF和Rad21，在基因座位内的相互作用频率下降的同时，KCNQ5的表达明显下调，但是下调的程度有差别，抑制CTCF对KCNQ5的表达影响更大。从而也进一步说明CTCF在介导kcnq5基因座位内的相互作用过程中发挥更为重要的组织作用。本文进一步验证了这些基因的表达与组蛋白的甲基化修饰有关；由于CTCF对组蛋白的修饰位点的敏感性，H3K4me3和H3K27me3在一定程度上也影响了染色体的空间上的结构组织模式，染色体的空间上的结构组织模式同样对相关基因的表达产生很重要的影响。　　 通过荧光素酶的报告系统的验证发现，CTCF所介导的kcnq5基因座位内的相互作用元件：CT6、225和319具有抑制报告基因表达的功能，是一种典型的沉默子。这些位点通过环出，并相互靠近，形成一个相对的沉默中心(Silencer Center，SiC)，而启动子区由于环出效应，远离沉默中心(Silencer Center)，受到的抑制影响相对较小，在一定程度上呈现活跃状态。　　 综上所述，以保守的CTCF结合位点为出发点，通过4C方法的筛选与3C的验证，发现了细胞特异性的染色体之间、之内的相互作用现象。通过ChIP、基因抑制和ChIP-loop的方法证明了CTCF、Cohesin介导这些相互作用的分子机制，通过介导染色质环出来，使那些转录调控元件相互靠近并发生相互作用，抑制或激活调控相关基因的表达。本文发现了两种类型的调控模式，揭示了CTCF在DNA-蛋白-DNA的高级相互作用网络中的调控机制，对进一步开展研究CTCF在介导核内三维调控网络中的作用具有十分典型的意义。