血吸虫病是一种严重危害人类健康的人兽共患寄生虫病。目前的防治策略主要是以吡喹酮化疗为主，结合药物灭螺、环境改造和健康教育的综合措施。鉴于历史上许多感染性疾病的控制均依赖于高效疫苗的成功研制和对血吸虫病免疫认识的逐步深入，作为综合防治措施之一，世界卫生组织已把发展血吸虫病疫苗确定为优先发展的战略。 目前，国内外研制的血吸虫病疫苗候选分子的保护力尚不够理想。其原因除了单一抗原分子不能诱导足够的免疫应答外，也可能与其所含的抗原表位的构成和性质有关。无论动物实验还是人群血吸虫病的免疫流行病学研究均提示Th1型应答在免疫保护中具有重要作用。因此，构建由诱导Th1应答的表位组成的复合多价疫苗或许能够提高免疫保护性。 本研究运用生物信息学方法分析和预测日本血吸虫线粒体相关蛋白(Sj338)、22.6 kDa膜相关抗原(Sj22.6)、磷酸丙糖异构酶(SjTPI)和97 kDa副肌球蛋白(Sj97)的T细胞表位，设计并合成候选表位的编码核苷酸，定向克隆入融合表达载体pET-32c(+)，诱导表达硫氧还蛋白(Trx)融合蛋白。候选表位融合蛋白纯化后体外刺激小鼠淋巴细胞，经淋巴细胞增殖实验和细胞因子分泌实验鉴定出若干能诱导Th1型细胞因子产生的T细胞表位。其中P4(来源于Sj22.6)、P18(来源于SjTPI)和P22(来源于Sj97)能够诱导较强的淋巴细胞增殖和Th1型细胞因子产生。同时对此三个T细胞表位进行了同源性分析，并进一步对P4、P22的免疫原性及P18与自然感染血吸虫小鼠淋巴细胞的反应性进行了研究。 第—部分：日本血吸虫抗原T细胞表位的预测、基因重组、表达及纯化 根据Sj22.6、Sj338、SjTPI和Sj97的氨基酸序列，用TEPITOPE、SYFPEITHI等计算机软件预测其T细胞表位，确定了候选表位14个。南京医科大学硕卜学位论文 设计候选表位的编码核普酸，定向克隆入融合表达载体PET-32c(+)，转化大肠杆菌BLZI，氨节青霉素琼脂板筛选阳性克隆。重组质粒(表位基因/P ET-32c(+))经酶切及测序鉴定。测序结果显示基因序列与设计完全一致，表明候选表位基因成功克隆入融合表达载体pET-32c(+)。 为获得大量可溶性的候选表位融合蛋白(表位~Trx)，对不同IPTG诱导浓度、诱导表达时间等因素对融合蛋白表达量的影响进行了观察。结果显示，大多rl丫x融合蛋白在1 .0 mm0llL lpTG诱导3h表达量均较高，而P6lT注在0.4 mmo此IpTG诱导Zh表达量最高. 以最佳诱导条件大量表达Trx融合蛋白，表达菌体培养物置一70℃，融化后离心取上清。用Ni2+~NTA柱亲和层析纯化目的蛋白并在PBS中透析。透析后蛋白经SDS一PAGE观察其纯度并测定浓度。结果表明，纯化后的融合蛋白呈均一性，在sDSPAGE上无任何可见杂带。第二部分日本血吸虫杭原T细胞表位的鉴定 为鉴定血吸虫特异性的T细月包表位，首先以日本血吸虫照射尾坳免疫C3H/H eJ及C57BL/6，J、鼠，5周后分别以rsj22.6、rsj338、rsjTpl和S认叭P加不完全福氏佐剂(IFA)尾基部皮下注射加强免疫。7一10天后无菌取腹股沟淋巴结及脾脏，制备淋巴细胞悬液。用纯化的候选表位融合蛋白与上述细胞共培养，’H一TdR掺入法检测其增殖。结果显示，候选表位融合蛋白中大部分可刺激致敏淋巴细胞增殖而不能刺激，j、鼠幼稚淋巴细胞增殖，表明候选表位中大部分为日本血吸虫特异性T细胞表位。 为排除融合蛋白中担体蛋白部分对实验的干扰，我们又合成了部分候选表位的氨基酸肤段。同上进才洲林巴细胞增殖实验及细胞因子分泌的检测。结果显示，合成肤与重组肤刺激淋巴细胞产生的增殖及细胞因子的分泌基本一致，表明表位肤与，n篮融合蛋白可以替代合成肤进行T细胞表位的筛选与鉴定。 在来源于22 .6切a抗原的4个候选表位中(用TEPITOPE软件预测获得)，其中3个(P4、PS、P6)既能诱导C3IJ/HeJ(井Zk)小鼠的致敏淋巴细胞增殖，又能诱导C 57BL/6(H-2“)，卜鼠的致敏淋巴细胞增殖，提示P4、Ps、P6可能是通用性T细胞表位。在来源于副月心味蛋白的5个候选表位中(用SYFPEIT扭软件根据H一ZAK和H一ZEK基序南京医科大学硕l学位论义预测获得的挤Zk限制性候选T细胞表位)，有4个(PZo、PZI、P22、P23)可刺激C3H汗leJ，」、鼠的致敏淋巴细胞增殖，仅两个(P20、P22)可诱导C57BU6小鼠的致敏淋巴细胞增殖，提示P20、件2可能为通用性T细胞表位，而PZI、P23可能为MHC限制性T细胞表位。TEprr0PE和SYFpEITHI软件预测T细胞表位具有较高的准确性. 为进一步筛选可用于构建多表位疫苗的可诱导Thl应答的T细胞表位，同上免疫小鼠，制备淋巴细胞悬液。用纯化的候选表位融合蛋白与淋巴细胞共培养24、48小时后收集细胞培养上清。EUSA双抗体夹，讼法用QuantikineM试剂盒检测细胞培养上清中IL一2及IFN一Y的含量。结果显示，上述鉴定的表位中大部分能刺激致敏淋巴细胞分泌IL一2及IFN一y，其中以P4、P18和P22能较强诱导，rk1型细胞因于的产生。 将表位P4、P 18、P22氨基酸序列上BLAST进行比对。结果显示，P4、P18、P22与哺乳动物无明显序列同源性。 一个有潜力的疫苗候选分子必须具有良好的免疫原性。为观察所选