目的:乙二醛还原酶Ⅰ(GlyoxalaseⅠ,简称Glo1)是乙二醛途经的一个重要部分,广泛存在于所有细胞质中,能催化多种带芳香基和脂肪基团的α—羰基醛向α—羟基硫脂转化。乙二醛酶Ⅰ的主要生理作用是与乙二醛酶Ⅱ协同将具有细胞毒性的甲基乙二醛转化为无毒的D-乳酸。脑组织中Glo1表达和活性水平的下降可能是导致阿兹海默病患者神经元蜕变的分子机制之一。Glo1基因还被认为与许多神经性疾病有关。病毒载体是目前转移基因的最优手段,其中慢病毒载体技术和腺病毒载体技术是最成熟的。慢病毒载体可以转染大部分已分化或未分化细胞并表达小干涉RNA(Shoa interference RNA,siRNA),其中包括终末分化的神经元。本研究采用三质粒系统在293T细胞(人胚胎肾上皮细胞293细胞系派生)中包装合成siGlo1重组慢病毒载体,并用慢病毒载体在体转染大鼠双侧海马脑区。Morris水迷宫是用于评估与啮齿类动物海马功能直接相关的空间学习记忆的重要工具,本研究采用隐蔽站台,动物通过其空间定位能力来确定站台位置,反映了脑内的空间参考记忆水平。通过比较定位航行实验的逃避潜伏期可以获取动物提取空间信息和学习能力的数据,而空间探索实验可以判断动物记忆储存能力及提取再现能力。本实验主要研究转染后Glo1基因沉默对大鼠空间学习记忆能力的影响,为进一步建立慢病毒载体介导动物体内特定部位实现RNA过表达或RNA干扰奠定基础,并为电生理膜片钳研究提供新的动物模型,同时为基因治疗的应用提供了实验参考。方法:1.慢病毒载体的包装制备:将载体质粒siGlo1和sihp53,以及包装质粒pMDL、pMD.G、pREV分别转化入感受态E.coli细胞,摇菌培养后,大量提取质粒,并测定质粒浓度。使用磷酸钙共沉淀法将质粒DNA转染293T细胞,收获含有病毒的培养基,浓缩后得到具有感染能力的siGlo1慢病毒载体和sihp53慢病毒载体。2.慢病毒载体的体内感染:将27只被试大鼠随机分为空白对照组、siGlo1组和sihp53组,对siGlo1组和sihp53组大鼠的双侧海马立体定位注射相应的慢病毒载体。手术1周后,进行Morris水迷宫行为测试。3.Morris水迷宫实验:分为定位航行实验和空间探索实验两部分。在定位航行实验中分析各组大鼠逃避潜伏期的差异。空间探索实验比较大鼠在不同象限停留时间的百分比、站台所在的第2象限停留占总游泳时间百分比和穿越原来站台所在位置的次数差异。4.SD大鼠双侧海马感染结果观察:将做完水迷宫实验的siGlo1组和sihp53组大鼠行心脏灌流固定,取脑切片,随机挑取部分脑片做DAPI复染。使用激光共聚焦显微镜观察荧光表达情况,并扫描存图,对荧光表达情况进行分析。结果:1.质粒DNA浓度:siGlo1(1.2μg/μl),sihp53(0.6μg/μl),pMDL(1.259μg/μl),pMD.G(1.512μg/μl),pREV(0.66μg/μl)。2.慢病毒载体滴度:sihp53病毒滴度为2.22×10~8,siGlo1病毒滴度为7.22×10~7。3.空间寻觅训练实验:3组大鼠的学习曲线都是随着训练时间的延长,逃避潜伏期逐渐变短,双因素方差分析显示各组间有显著性差异(P＜0.05)。siGlo1组在训练的最初2天学得较2个对照组快,但是后3天成绩提高缓慢,落后于2个对照组。4.空间定向能力测试:统计结果显示3组大鼠在第2象限的时间比例最大。siGlo1组在第2象限停留的时间极显著地少于Blank组(P＜0.01),也显著地少于sihp53组(P＜0.05)。siGlo1组大鼠穿越站台的次数进行比另两组大鼠少,但显著不差异(P＞0.05)。5.SD大鼠双侧海马EGFP表达良好,证明siGlo1慢病毒载体在体感染率达到较高水平。结论:1.成功合成了具有高效感染siGlo1慢病毒载体和sihp53慢病毒载体,并实现在了在大鼠海马部位的特定感染,EGFP荧光表达效果良好。2.大鼠海马Glo1基因与空间学习记忆有关,Glo1沉默可导致大鼠在水迷宫实验中学习和记忆能力下降,但随着训练次数增加最终仍能完成学习任务。